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摘要目的：研究大鼠腰椎小关节在炎症状态下的神经支配模式的多元性及其传导机制。方法：通过逆行神经追踪法，将荧光金注入大鼠左侧L5/6小关节内。5天后，分别将50μl生理盐水或弗氏佐剂注入对照组或实验组。第一次术后12天，麻醉后经心脏用0.9％的盐水，紧跟着500ml 4％ 多聚甲醛磷酸缓冲液（0.1M, PH 7.4）灌注。取双侧T13-L6水平的DRGs，冰冻切片后分组行SP和IB4免疫组化，最后用荧光显微镜观察计数F-G标记神经元与SP和IB4阳性神经元，并测量每个神经元的横截面积。结果：支配大鼠L5/6小关节的神经元分布于同侧的L1-L5 DRGs。在所有F-G标记的神经元中，实验组SP阳性神经元的比例为36%±3%（Mean±S.E.）明显高于对照组的21%±2%（P<0.01），前者SP阳性神经元的横截面积为900.1±34.8μm2，也明显大于对照组的738.8±30.2μm2（P<0.01）。两组中均未发现IB4阳性神经元。无论是实验组还是对照组，L3-L5 DRG中SP阳性神经元的比例均高于L1和L2中的比例。结论：大鼠L5/6小关节是由以NGF依赖性神经元为主的同侧L1-L5DRG神经元多节段支配的。炎症可使与大鼠L5\6小关节相应的DRG中SP阳性NGF依赖性神经元数目增加，横截面积增大，这可能是小关节炎症通过NGF依赖性神经元传导机制的一种表达，理论上抗NGF治疗对于由炎症介导的下腰痛应具有良好的镇痛作用。
关键词下腰痛；小关节；炎症；背根节；P物质；IB4；神经生长因子；神经胶质细胞源性神经营养因子
下腰痛十分常见，由于其原因和发生机制十分复杂，因此临床上诊治仍十分困难。腰椎小关节病变是导致下腰痛的主要原因之一1, 2, 3。传统的理论认为腰骶椎的结构包括小关节是由节段性分布的脊神经背支的内侧分支支配4。但这种节段性的神经支配模式并不能解释临床上常见的因下腰椎小关节病变导致的髋关节前方的牵涉痛。因此阐明腰椎小关节源性下腰痛的神经支配与传导模式十分必要。
本实验采用逆行神经追踪和免疫组化方法研究大鼠L5/6小关节在生理和炎症状态下神经支配途径和对应背根神经节内不同神经元的表达，从而在分子生物学角度探讨腰椎小关节的神经支配模式以及小关节源性下腰痛可能的产生机制。
1材料和方法
取重约250-300g的SD大鼠（由浙江省医学科学院提供），分对照组和实验组，各16只。腹腔内注射硫喷妥钠（30mg/kg）麻醉，在无菌原则下，显露左侧L5/6小关节，将一枚针尖上填有荧光金(Fluoro-gold, F-G； Fluorochrome, Biotium，Hayward，CA, USA)晶体的24号留置针刺进L5/6小关节，针眼用氰基丙烯酸盐粘合剂封闭，缝合筋膜和皮肤。术后5天将50μl 弗氏佐剂(Mycobacterium butyricum in a saline-in-oil emulsion； Sigma, St. Louis, MO) 注射到实验组大鼠的同个小关节中，对照组则注射50μl生理盐水。第一次术后12天再次麻醉后，经心脏先用生理盐水，紧接500ml 4％ 的多聚甲醛磷酸缓冲液（0.1M, PH 7.4）灌注，最后取大鼠双侧T13-L6的背根节（Dorsal root ganglion, DRG）。
标本在4°C恒温下泡入同种固定液中过夜，然后置于4°C含20％蔗糖的0.01M的磷酸缓冲盐水（PBS）20小时，再连续切片，片厚20μm，予以全部收集于载玻片上。在室温下用抗体稀释液（含0.3％Triton X-100和1％ 牛血清白蛋白的0.01M PBS）处理90分钟。每组各取8只大鼠的DRGs分别进行P物质(substance P, SP)和 IB4(isolectin B4, IB4)的免疫组化，在4°C下用抗体稀释液稀释的兔抗SP的多克隆抗体（1:100，Biomeda，Foster City，CA）及IB4(12.5μg/ml biotinylated IB4; Sigma, St. Louis, MO) 反应20小时。接着用Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG（对SP；1:400；Molecular Probes Inc, Eugene, OR）及Alexa Fluor 488 conjugate of streptavidin(对IB4；1:400； Molecular Probes Inc, Eugene, OR)培养2小时。每一步结束后，切片都用0.01M PBS漂洗3次。
最后，采用荧光显微镜以看到细胞核为准，分别对所有F-G标记的神经元以及F-G标记的SP-ir或IB4结合的神经元进行计数，并用ImageTool（UTHSCSA ImageTool for windows, version 3.0）通过测量每个神经元的的灰度计算其横截面积。
用非对照Welch’s t-test (GraphPad QuickCalcs, GraphPad software Inc. San Diego, CA）进行统计学分析，P<0.05有统计意义。
2结果
本实验所有32只大鼠的双侧T13-L6共448个背根节中，仅在同侧L1到L5的DRG中发现F-G标记的神经元，而对侧所有的DRG以及同侧的T13和L6 DRG中未发现F-G标记的神经元。
图1. 显示FG标记（A，C，E，F），SP阳性（B），以及IB4结合神经元(D)。其中A和B箭头所示为L4DRG中的同一神经元细胞，即FG标记SP阳性阳性神经元。C和D箭头所示为L3DRG中的同一神经元，FG标记IB4阴性神经元。E箭头所示为大直径神经元，其横截面积为1464.9μm2；F箭头所示为小直径神经元，其横截面积为548.4μm2。标尺=50μm.
Fig1.Fluorescent photomicrographs show the F-G-labeled (A, C), SP-ir (B) or IB4-binding (D) neurons. (B)
2.1对照组
在行SP免疫组化的8只大鼠中，我们总共发现321个F-G标记的神经元，而SP阳性神经元在各DRG中的数目分别为L1：5，L2：9，L3：21，L4：20，L5：13，L1及L2背根节SP阳性神经元的数目明显少于L3、L4和L5中的，两者差别有高度显著性意义，P<0.001（图2）。行IB4免疫组化的8只大鼠中有294个F-G标记的神经元，但未发现一个IB4结合神经元（图1）。
2.2实验组
在行SP免疫组化的8只大鼠中，总共发现310个F-G标记的神经元，其中SP阳性神经元的数目分别为L1：10，L2：12，L3：31，L4：32，L5：26，在L1及L2背根节中的数目明显小于L3、L4和L5中的，两者差别有高度显著性意义，P<0.001（图1、2）。行IB4免疫组化的8只大鼠共发现312个F-G标记的神经元，但无一个IB4结合神经元（图1）。
2.3对照组和实验组的比较
实验组和对照组中F-G标记神经元的总数量分别为622和615，行SP免疫组化的大鼠中F-G标记神经元的总数分别为310和321，两组之间的差异均无显著性意义。但在炎症组中SP阳性F-G标记的神经元所占的比例为36%±3%，明显高于对照组的21%±2%，P0.01，差异有高度显著性意义。两组中均未发现IB4结合神经元。
图2. 各个背根神经节中SP阳性神经元的数目。对照组及实验组中SP阳性神经元在L1和L2中的数目均明显少于L3、L4、L5中的比例，P<0.001，差别有高度统计意义。
Fig2. The figure shows the number of SP-ir neurons in each DRG. The number of SP-ir neurons in L1 and L2 DRGs was significantly lower than those in L3-5 DRGs, P<0.001, the difference was considered to be statistically significant.
2.4SP阳性的F-G标记神经元的横截面积
我们测量并统计了行SP免疫组化的16只大鼠所有的F-G标记神经元的横截面积。实验组平均的横截面积为807.4±18.8μm2（Mean±S.E.），对照组平均的横截面积为777.3±17.7μm2，两者之间的差别无明显统计意义。然而，我们对于SP阳性的神经元的横截面积进行测量后发现，实验组的平均为900.1±34.8μm2，对照组平均为738.8±30.2μm2，两者的差别有高度统计意义，实验组SP阳性神经元的横截面积明显大于对照组，P<0.01。
3讨论
导致下腰痛的原因很多，而腰骶椎小关节病变作为其主要因素之一，也颇受关注。因此厘清小关节的神经支配模式十分必要。传统的理论认为小关节主要接受来自脊神经背支的内侧分支的感觉神经支配，呈节段性分布4。但是这种节段性神经支配学说不能解释临床上下腰椎小关节病变的患者有时会出现腹股沟及大腿前方的疼痛。于是有学者对大鼠腰椎不同部位的神经支配模式进行了研究，提出包括小关节在内的腰椎结构的多节段神经支配理论，即相对应节段的脊神经背支和通过交感干的L1和L2DRG的双重支配5, 6, 11。本实验采用逆行神经追踪法将FG标记物注射到大鼠L5/6小关节内，结果在同侧L1-L5的DRG中找到FG标记的神经元，而同侧的T13和L6DRG和对侧T13-L6 DRG则没有发现FG标记神经元。这与Suseki等5, 6的实验结果一致，即支配L5/6小关节感觉神经的节段性的L3-5DRG神经元和通过椎旁交感干的L1及L2DRG神经元间接支配途径，且以前者为主。大鼠的L5/6小关节相当于人类的L4/5小关节，如果人类腰椎小关节也存在相似的神经支配模式，那么就可以解释临床上L4-5和L5S1小关节内注射水溶性造影剂或生理盐水可诱发腹股沟及大腿前方（属于L1、L2感觉皮节）的疼痛，而在注射局麻药后消失；同时临床上L4-5和L5S1小关节损伤的患者一旦行腰交感干阻滞后，其下腰痛症状也可减轻等临床问题。
许多研究证实了DRG神经元可以分为两个亚群：与本体感受有关的大直径和与痛觉有关的小直径感觉神经元7, 8, 9。小神经元可进一步分为神经生长因子（nerve growth factor, NGF）依赖性神经元（含肽神经元）和神经胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF）依赖性神经元（非含肽神经元）。有关含肽神经元（SP阳性）和非含肽神经元（IB4）在DGR中的比例和分布受感觉神经支配部位和原发损伤的类型影响。Bennett等14, 15采用逆行神经追踪法发现分布于皮肤和膀胱感觉神经对应DRG中F-G表达神经元中约有25-50％是IB4阳性神经元，且前者比例高于后者（分别为43％和29％）。Ozawa12和Aoki13等在其各自的免疫组化实验中均只发现了一个支配L5/6椎间盘的IB4结合神经元。Ivanavicius16研究发现支配大鼠膝关节的神经元中没有IB4结合神经元。本实验对照组和实验组共606个F-G标记神经元中没有一个IB4结合神经元，结合文献分析，关节组织中可能缺乏IB4结合神经元的支配，接受腰椎小关节中痛觉信息的主要是NGF依赖性神经元。另有研究表明组织炎症引起的慢性疼痛主要与NGF依赖性神经元有关的，而IB4结合神经元则与神经损伤引起的慢性疼痛有关17, 18。因此研究小关节炎症对DGR内神经元表达的影响，对于探讨小关节源性下腰痛的发病机制十分重要。
弗氏佐剂作为一种高效的至炎物质用于动物实验中制造炎症模型已有几十年，并且效果确切13, 19, 20。本组实验中实验组采用小关节内注射弗氏佐剂制造小关节的炎症模型，而对照组则注射生理盐水。尽管两组中F-G标记神经元的数量无显著差别，但实验组中SP阳性神经元所占比例显著高于对照组。而且通过对SP阳性神经元的横截面积的计算，我们发现实验组中出现了一些SP阳性的大直径（＞1400μm2）神经元，经统计比较表明实验组中SP阳性神经元的平均横截面积明显大于对照组。Aoki等13在大鼠L5\6椎间盘注入弗氏佐剂造成炎症后发现，支配L5\6椎间盘的CGRP阳性NGF依赖性神经元不仅数量增多，而且横截面积增大，他们认为在生理状态下DRG中可能存在一些CGRP阴性的NGF依赖性的大直径或小直径神经元，而在炎症刺激下则可表达CGRP。本实验也提示了小关节炎症可使DRG中SP阳性神经元数目增加，体积增大。已有研究表明NGF表达的上升可导致组织产生痛觉过敏 21, 22。因此，我们推测DRG神经元中SP阴性的NGF依赖性的大直径或小直径神经元，在炎症的刺激下，转而表达SP，从而使SP和CGRP等疼痛相关细胞因子表达上调，NGF高亲和力受体trkA的表达亦随之上升，导致疼痛或使小关节处于一种高敏状态，而在这种状态下，即使是生理性的负荷也会产生疼痛。许多学者也报道了NGF与多种炎症性疼痛的产生有关，并且抗NGF治疗能有效的缓解这些疼痛23, 24。而炎症导致的SP阳性神经元增加，可能是小关节炎症通过NGF依赖性神经元传导机制的一种表达，因此理论上抗NGF治疗对于由炎症介导的下腰痛应具有良好的镇痛作用。
参考文献
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注：基金项目 浙江省医药卫生科学研究基金（2005B176）
关键词下腰痛；小关节；炎症；背根节；P物质；IB4；神经生长因子；神经胶质细胞源性神经营养因子
下腰痛十分常见，由于其原因和发生机制十分复杂，因此临床上诊治仍十分困难。腰椎小关节病变是导致下腰痛的主要原因之一1, 2, 3。传统的理论认为腰骶椎的结构包括小关节是由节段性分布的脊神经背支的内侧分支支配4。但这种节段性的神经支配模式并不能解释临床上常见的因下腰椎小关节病变导致的髋关节前方的牵涉痛。因此阐明腰椎小关节源性下腰痛的神经支配与传导模式十分必要。
本实验采用逆行神经追踪和免疫组化方法研究大鼠L5/6小关节在生理和炎症状态下神经支配途径和对应背根神经节内不同神经元的表达，从而在分子生物学角度探讨腰椎小关节的神经支配模式以及小关节源性下腰痛可能的产生机制。
1材料和方法
取重约250-300g的SD大鼠（由浙江省医学科学院提供），分对照组和实验组，各16只。腹腔内注射硫喷妥钠（30mg/kg）麻醉，在无菌原则下，显露左侧L5/6小关节，将一枚针尖上填有荧光金(Fluoro-gold, F-G； Fluorochrome, Biotium，Hayward，CA, USA)晶体的24号留置针刺进L5/6小关节，针眼用氰基丙烯酸盐粘合剂封闭，缝合筋膜和皮肤。术后5天将50μl 弗氏佐剂(Mycobacterium butyricum in a saline-in-oil emulsion； Sigma, St. Louis, MO) 注射到实验组大鼠的同个小关节中，对照组则注射50μl生理盐水。第一次术后12天再次麻醉后，经心脏先用生理盐水，紧接500ml 4％ 的多聚甲醛磷酸缓冲液（0.1M, PH 7.4）灌注，最后取大鼠双侧T13-L6的背根节（Dorsal root ganglion, DRG）。
标本在4°C恒温下泡入同种固定液中过夜，然后置于4°C含20％蔗糖的0.01M的磷酸缓冲盐水（PBS）20小时，再连续切片，片厚20μm，予以全部收集于载玻片上。在室温下用抗体稀释液（含0.3％Triton X-100和1％ 牛血清白蛋白的0.01M PBS）处理90分钟。每组各取8只大鼠的DRGs分别进行P物质(substance P, SP)和 IB4(isolectin B4, IB4)的免疫组化，在4°C下用抗体稀释液稀释的兔抗SP的多克隆抗体（1:100，Biomeda，Foster City，CA）及IB4(12.5μg/ml biotinylated IB4; Sigma, St. Louis, MO) 反应20小时。接着用Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG（对SP；1:400；Molecular Probes Inc, Eugene, OR）及Alexa Fluor 488 conjugate of streptavidin(对IB4；1:400； Molecular Probes Inc, Eugene, OR)培养2小时。每一步结束后，切片都用0.01M PBS漂洗3次。
最后，采用荧光显微镜以看到细胞核为准，分别对所有F-G标记的神经元以及F-G标记的SP-ir或IB4结合的神经元进行计数，并用ImageTool（UTHSCSA ImageTool for windows, version 3.0）通过测量每个神经元的的灰度计算其横截面积。
用非对照Welch’s t-test (GraphPad QuickCalcs, GraphPad software Inc. San Diego, CA）进行统计学分析，P<0.05有统计意义。
2结果
本实验所有32只大鼠的双侧T13-L6共448个背根节中，仅在同侧L1到L5的DRG中发现F-G标记的神经元，而对侧所有的DRG以及同侧的T13和L6 DRG中未发现F-G标记的神经元。
图1. 显示FG标记（A，C，E，F），SP阳性（B），以及IB4结合神经元(D)。其中A和B箭头所示为L4DRG中的同一神经元细胞，即FG标记SP阳性阳性神经元。C和D箭头所示为L3DRG中的同一神经元，FG标记IB4阴性神经元。E箭头所示为大直径神经元，其横截面积为1464.9μm2；F箭头所示为小直径神经元，其横截面积为548.4μm2。标尺=50μm.
Fig1.Fluorescent photomicrographs show the F-G-labeled (A, C), SP-ir (B) or IB4-binding (D) neurons. (B)
2.1对照组
在行SP免疫组化的8只大鼠中，我们总共发现321个F-G标记的神经元，而SP阳性神经元在各DRG中的数目分别为L1：5，L2：9，L3：21，L4：20，L5：13，L1及L2背根节SP阳性神经元的数目明显少于L3、L4和L5中的，两者差别有高度显著性意义，P<0.001（图2）。行IB4免疫组化的8只大鼠中有294个F-G标记的神经元，但未发现一个IB4结合神经元（图1）。
2.2实验组
在行SP免疫组化的8只大鼠中，总共发现310个F-G标记的神经元，其中SP阳性神经元的数目分别为L1：10，L2：12，L3：31，L4：32，L5：26，在L1及L2背根节中的数目明显小于L3、L4和L5中的，两者差别有高度显著性意义，P<0.001（图1、2）。行IB4免疫组化的8只大鼠共发现312个F-G标记的神经元，但无一个IB4结合神经元（图1）。
2.3对照组和实验组的比较
实验组和对照组中F-G标记神经元的总数量分别为622和615，行SP免疫组化的大鼠中F-G标记神经元的总数分别为310和321，两组之间的差异均无显著性意义。但在炎症组中SP阳性F-G标记的神经元所占的比例为36%±3%，明显高于对照组的21%±2%，P0.01，差异有高度显著性意义。两组中均未发现IB4结合神经元。
图2. 各个背根神经节中SP阳性神经元的数目。对照组及实验组中SP阳性神经元在L1和L2中的数目均明显少于L3、L4、L5中的比例，P<0.001，差别有高度统计意义。
Fig2. The figure shows the number of SP-ir neurons in each DRG. The number of SP-ir neurons in L1 and L2 DRGs was significantly lower than those in L3-5 DRGs, P<0.001, the difference was considered to be statistically significant.
2.4SP阳性的F-G标记神经元的横截面积
我们测量并统计了行SP免疫组化的16只大鼠所有的F-G标记神经元的横截面积。实验组平均的横截面积为807.4±18.8μm2（Mean±S.E.），对照组平均的横截面积为777.3±17.7μm2，两者之间的差别无明显统计意义。然而，我们对于SP阳性的神经元的横截面积进行测量后发现，实验组的平均为900.1±34.8μm2，对照组平均为738.8±30.2μm2，两者的差别有高度统计意义，实验组SP阳性神经元的横截面积明显大于对照组，P<0.01。
3讨论
导致下腰痛的原因很多，而腰骶椎小关节病变作为其主要因素之一，也颇受关注。因此厘清小关节的神经支配模式十分必要。传统的理论认为小关节主要接受来自脊神经背支的内侧分支的感觉神经支配，呈节段性分布4。但是这种节段性神经支配学说不能解释临床上下腰椎小关节病变的患者有时会出现腹股沟及大腿前方的疼痛。于是有学者对大鼠腰椎不同部位的神经支配模式进行了研究，提出包括小关节在内的腰椎结构的多节段神经支配理论，即相对应节段的脊神经背支和通过交感干的L1和L2DRG的双重支配5, 6, 11。本实验采用逆行神经追踪法将FG标记物注射到大鼠L5/6小关节内，结果在同侧L1-L5的DRG中找到FG标记的神经元，而同侧的T13和L6DRG和对侧T13-L6 DRG则没有发现FG标记神经元。这与Suseki等5, 6的实验结果一致，即支配L5/6小关节感觉神经的节段性的L3-5DRG神经元和通过椎旁交感干的L1及L2DRG神经元间接支配途径，且以前者为主。大鼠的L5/6小关节相当于人类的L4/5小关节，如果人类腰椎小关节也存在相似的神经支配模式，那么就可以解释临床上L4-5和L5S1小关节内注射水溶性造影剂或生理盐水可诱发腹股沟及大腿前方（属于L1、L2感觉皮节）的疼痛，而在注射局麻药后消失；同时临床上L4-5和L5S1小关节损伤的患者一旦行腰交感干阻滞后，其下腰痛症状也可减轻等临床问题。
许多研究证实了DRG神经元可以分为两个亚群：与本体感受有关的大直径和与痛觉有关的小直径感觉神经元7, 8, 9。小神经元可进一步分为神经生长因子（nerve growth factor, NGF）依赖性神经元（含肽神经元）和神经胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF）依赖性神经元（非含肽神经元）。有关含肽神经元（SP阳性）和非含肽神经元（IB4）在DGR中的比例和分布受感觉神经支配部位和原发损伤的类型影响。Bennett等14, 15采用逆行神经追踪法发现分布于皮肤和膀胱感觉神经对应DRG中F-G表达神经元中约有25-50％是IB4阳性神经元，且前者比例高于后者（分别为43％和29％）。Ozawa12和Aoki13等在其各自的免疫组化实验中均只发现了一个支配L5/6椎间盘的IB4结合神经元。Ivanavicius16研究发现支配大鼠膝关节的神经元中没有IB4结合神经元。本实验对照组和实验组共606个F-G标记神经元中没有一个IB4结合神经元，结合文献分析，关节组织中可能缺乏IB4结合神经元的支配，接受腰椎小关节中痛觉信息的主要是NGF依赖性神经元。另有研究表明组织炎症引起的慢性疼痛主要与NGF依赖性神经元有关的，而IB4结合神经元则与神经损伤引起的慢性疼痛有关17, 18。因此研究小关节炎症对DGR内神经元表达的影响，对于探讨小关节源性下腰痛的发病机制十分重要。
弗氏佐剂作为一种高效的至炎物质用于动物实验中制造炎症模型已有几十年，并且效果确切13, 19, 20。本组实验中实验组采用小关节内注射弗氏佐剂制造小关节的炎症模型，而对照组则注射生理盐水。尽管两组中F-G标记神经元的数量无显著差别，但实验组中SP阳性神经元所占比例显著高于对照组。而且通过对SP阳性神经元的横截面积的计算，我们发现实验组中出现了一些SP阳性的大直径（＞1400μm2）神经元，经统计比较表明实验组中SP阳性神经元的平均横截面积明显大于对照组。Aoki等13在大鼠L5\6椎间盘注入弗氏佐剂造成炎症后发现，支配L5\6椎间盘的CGRP阳性NGF依赖性神经元不仅数量增多，而且横截面积增大，他们认为在生理状态下DRG中可能存在一些CGRP阴性的NGF依赖性的大直径或小直径神经元，而在炎症刺激下则可表达CGRP。本实验也提示了小关节炎症可使DRG中SP阳性神经元数目增加，体积增大。已有研究表明NGF表达的上升可导致组织产生痛觉过敏 21, 22。因此，我们推测DRG神经元中SP阴性的NGF依赖性的大直径或小直径神经元，在炎症的刺激下，转而表达SP，从而使SP和CGRP等疼痛相关细胞因子表达上调，NGF高亲和力受体trkA的表达亦随之上升，导致疼痛或使小关节处于一种高敏状态，而在这种状态下，即使是生理性的负荷也会产生疼痛。许多学者也报道了NGF与多种炎症性疼痛的产生有关，并且抗NGF治疗能有效的缓解这些疼痛23, 24。而炎症导致的SP阳性神经元增加，可能是小关节炎症通过NGF依赖性神经元传导机制的一种表达，因此理论上抗NGF治疗对于由炎症介导的下腰痛应具有良好的镇痛作用。
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注：基金项目 浙江省医药卫生科学研究基金（2005B176）