类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一类常见的系统性慢性自身免疫性疾病,以疼痛、肿胀、持续性滑膜炎,进行性破坏手、脚等小关节,最终导致功能障碍为特点。约有20-30%未接受治疗的RA患者,一年内可能导致永久性功能丧失,严重影响患者的健康和生活质量。大量常规药物如改善病情抗风湿性药（Disease-modifying antirheumatic drugs,DMARDs）和非甾体抗炎药（Nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs）被广泛用于RA的治疗,然而长期使用后药物的不良反应较大。随着对炎症免疫通路的进一步了解,一些靶向炎性细胞因子如B细胞、T细胞共刺激、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）等的新型药物被用于治疗RA,疗效好的同时也可引起较严重不良反应、广泛免疫抑制,以及诱发恶性感染和肿瘤等,难以长期应用。这些治疗方法还存在对部分RA患者无效或反应低下的情况,或开始阶段有治疗效果,一段时间后出现耐药。引起这些问题的原因多样,而免疫球蛋白D的水平升高可能是原因之一。免疫球蛋白D（Immunoglobulin D,IgD）包括分泌型IgD（secreted IgD,sIgD）和膜结合型IgD（membrane IgD,mIgD）。许多淋巴细胞和非淋巴细胞表达表面膜受体,其特异性结构位于免疫球蛋白分子的恒定区域（Fc region,FcR）,1985年发现IgD受体（IgD receptor,IgDR）在T细胞上表达,IgD可与IgDR结合发挥功能。定量免疫荧光技术显示IgD与T细胞和嗜碱性细胞系结合,IgD可能通过IgDR参与调控T细胞功能。课题组研究发现,sIgD在54例RA患者中的平均浓度为91.93μg/ml,远高于健康对照者（19.8μg/ml）。有文献报道,在约35%的RA患者中发现抗IgD抗体的浓度升高,而对于成年人RA,约有55%的患者血清中抗IgD抗体的浓度明显升高,提示IgD-IgDR可能是治疗针对IgD水平升高的RA患者的一个新靶点。特异性阻断IgD-IgDR信号转导可能成为IgD高水平RA的免疫新疗法。课题组以IgD-IgDR为靶点,已经成功将人IgD-Fc段与人IgG₁-Fc段连接并合成了融合蛋白IgD-Fc-Ig,旨在特异性阻断IgD-IgDR通路,高选择性抑制T细胞的异常增殖与活化,已获得中国发明专利授权（201510600762X）,本课题以RA患者PBMCs为研究对象,检测IgD对RA患者PBMCs功能的作用及IgD-Fc-Ig融合蛋白对IgD上述作用的影响,并通过小鼠建立胶原性关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）模型,在整体水平观察IgD-Fc-Ig对CIA小鼠的治疗作用及部分机制。以IgD-IgDR作为新靶点,为IgD-Fc-Ig治疗IgD高水平RA的创新药物研究提供实验依据。目的:明确IgD对RA患者PBMCs功能的影响及IgD-Fc-Ig的作用,揭示IgD-Fc-Ig对小鼠CIA的治疗作用及部分机制。方法:收集RA患者外周血,通过Ficoll密度梯度离心法得到RA患者PBMCs,CCK-8检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导RA患者PBMCs增殖能力的影响;流式细胞术检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导RA患者PBMCs表面活化分子（CD4⁺/CD69⁺和CD4⁺/CD154⁺）百分比和细胞亚群（CD4⁺/INFγ⁺、CD4⁺/IL-4⁺、CD4⁺/IL-17⁺、CD4⁺/CD25⁺/FoxP3⁺）百分比的影响;QPCR技术检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导RA患者T细胞特异性核转录因子（Tbet、GATA、RORγt、FoxP3）mRNA表达的影响;ELISA检测CIA小鼠血浆IgD的水平;分析IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与关节肿胀数、关节炎指数评分的相关性;研究IgD-Fc-Ig对CIA小鼠整体指标（体重、关节肿胀数、关节炎指数）和脾脏及踝关节病理学改变的影响;探讨IgD-Fc-Ig对CIA小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响;CCK-8法检测IgD-Fc-Ig对CIA小鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞增殖的影响;流式细胞术检测IgD-Fc-Ig对CIA小鼠细胞表面活化分子（CD4⁺/CD154⁺）百分比和细胞亚群（CD4⁺/INFγ⁺、CD4⁺/IL-4⁺、CD4⁺/IL-17⁺、CD4⁺/CD25⁺/FoxP3⁺、B220⁺/IgM⁺/IgD⁺）百分比的影响;抗体芯片技术检测IgD-Fc-Ig对CIA小鼠血浆IL-1α、IL-15、MCP-5、MCSF水平的影响;分析IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与IL-1α、IL-15、MCP-5、MCSF水平的相关性;Western blot法检测CIA小鼠脾脏Lck、p-Lck、ZAP70、p-ZAP70蛋白表达的影响。结果:1.RA患者人口学特征和临床指标收集33例RA患者,男女比例为6:27,年龄（age,years）、类风湿因子（RF,IU/ml）、C反应蛋白（CRP,mg/L）、红细胞沉降率（ESR,mm/h）及抗环瓜氨酸多肽（Anti-CCP,RU/ml）的均数±标准误值分别为57.24±2.07、171.1±23.8、36.71±5.903、64.7±4.872、683.9±55.04。2.IgD及IgD-Fc-Ig对RA患者T细胞功能的影响IgD（3μg/ml）刺激48h后可显著促进RA患者PBMCs增殖,IgD-Fc-Ig在10μg/ml时可明显抑制IgD诱导RA患者PBMCs的增殖能力;IgD（3μg/ml）刺激48h后显著增加RA患者T细胞表面活化分子（CD4⁺/CD69⁺、CD4⁺/CD154⁺）百分比,IgD-Fc-Ig（10μg/ml）能明显降低IgD诱导RA患者CD4⁺/CD69⁺和CD4⁺/CD154⁺细胞百分比;IgD（3μg/ml）刺激48h后显著增加RA患者Th17（CD4⁺/IL-17⁺）细胞百分比,上调RA患者Th17特异性核转录因子ROR-γt mRNA的表达,降低Treg（CD4⁺/CD25⁺/FoxP3⁺）细胞百分比,下调Treg特异性核转录因子FoxP3 mRNA的表达。IgD-Fc-Ig（10μg/ml）显著降低IgD诱导RA患者Th17细胞百分比,IgD-Fc-Ig（3,10μg/ml）下调IgD诱导RA患者ROR-γt mRNA的表达;IgD-Fc-Ig（3,10μg/ml）显著升高IgD诱导RA患者Treg细胞百分比,IgD-Fc-Ig（1,3,10μg/ml）上调IgD诱导RA患者FoxP3 mRNA的表达。IgD（3μg/ml）刺激48h以及IgD-Fc-Ig对RA患者Th1、Th2细胞百分比及Th1、Th2细胞特异性核转录因子Tbet、GATA mRNA的表达无明显影响。3.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠整体指标的影响CIA组小鼠体重自d21开始下降,体重变化与正常组体重比较,从d33开始差异显著,一直持续到d44,d44后体重增加与正常组体重增加值比较无明显差异,各给药组间体重变化无明显变化;d33-d54,抗IgD抗体可明显降低CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数,d37-d54,rhTNFR:Fc可明显降低CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数;d47-d54,IgD-Fc-Ig（3.25,6.5mg/kg）可明显降低CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数;d50后,IgD-Fc-Ig（13mg/kg）也降低CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数,IgD-Fc-Ig（1.625mg/kg）以及IgG₁-Fc（13mg/kg）阴性对照组对CIA小鼠关节肿胀数和关节炎指数无明显影响。4.CIA小鼠血浆IgD水平的变化与正常组比较,CIA小鼠血浆IgD水平明显升高。5.IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与关节肿胀数、关节炎指数的相关性IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与关节肿胀数、关节炎指数评分呈负相关,血浆IgD水平高的IgD-Fc-Ig给药组,小鼠关节肿胀数、关节炎指数评分较低,关节肿胀改善较明显。6.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠踝关节脾脏病理变化的影响与正常组比较,CIA小鼠关节明显可见滑膜组织增生,炎细胞浸润、血管扩张充血、血管翳出现,以及骨或软骨破坏;IgG₁-Fc（13mg/kg）和IgD-Fc-Ig（1.625mg/kg）无明显改善作用;IgD-Fc-Ig（3.25,6.5mg/kg）剂量组、rhTNFR:Fc组以及抗IgD抗体组滑膜细胞增生明显减少,炎细胞浸润、血管充血、血管翳生成等均有明显改善趋势。与正常组比较,CIA鼠可见白髓增生、生发中心出现、红髓增生、淋巴滤泡增生、炎症细胞浸润。IgG₁-Fc（13mg/kg）和IgD-Fc-Ig（1.625mg/kg）无明显改善趋势,IgD-Fc-Ig（3.25,6.5,13 mg/kg）剂量组、rhTNFR:Fc组以及抗IgD抗体组与模型组比较,淋巴滤泡增生和炎症细胞浸润明显减轻,生发中心减少。7.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响与正常组相比,CIA小鼠胸腺和脾脏明显肿大,指数增加。IgD-Fc-Ig（3.25,6.5,13mg/kg）剂量组、rhTNFR:Fc组以及抗IgD抗体组对胸腺指数均有明显下调作用,抗IgD抗体组对CIA小鼠脾脏指数有明显下调作用,而IgD-Fc-Ig（1.625mg/kg）、rhTNFR:Fc、IgG₁-Fc对脾脏指数没有显著影响。8.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞增殖的影响CIA小鼠T、B淋巴细胞增殖反应明显增高,IgD-Fc-Ig（3.25,6.5mg/kg）剂量组能明显下调CIA小鼠胸腺T细胞增殖反应,IgD-Fc-Ig（3.25,6.5,13mg/kg）剂量组能明显下调CIA小鼠脾脏B细胞增殖反应。IgD-Fc-Ig（1.625mg/kg）对CIA小鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞增殖无明显影响。9.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠T细胞亚群、B细胞亚群的影响与正常组比较,CIA组脾脏总Th细胞（CD3⁺/CD4⁺）、表达CD40L的Th细胞（CD4⁺/CD154⁺）、Th1细胞（CD4⁺/IFN-γ⁺）、Th17细胞（CD4⁺/IL-17⁺）以及成熟B细胞（B220⁺/IgM⁺/IgD⁺）比例显著升高,Th2细胞（CD4⁺/IL-4⁺）和Treg细胞（CD4⁺/CD25⁺/Foxp3⁺）比例显著降低,IgD-Fc-Ig（3.25,6.5,13mg/kg）剂量组可明显下调总Th细胞、表达CD40L的Th细胞、Th1细胞、Th17细胞百分比,IgD-Fc-Ig（3.25,6.5mg/kg）剂量组可明显上调Th2细胞的百分比,IgD-Fc-Ig（6.5,13mg/kg）剂量组可明显上调Treg细胞的百分比;IgD-Fc-Ig（3.25,6.5,13mg/kg）剂量组可明显下调成熟B细胞的百分比。10.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠血浆IL-1α、IL-15、MCP5、MCSF水平的影响与正常组比较,CIA小鼠血浆IL-1α、IL-15、MCP5、MCSF表达明显升高,IgD-Fc-Ig（1.625,3.25,6.5,13mg/kg）剂量组可明显下调CIA小鼠血浆IL-1α的表达,IgD-Fc-Ig（1.625,3.25,6.5mg/kg）剂量组可明显下调CIA小鼠血浆IL-15的表达,IgD-Fc-Ig（3.25,6.5,13mg/kg）剂量组可明显下调CIA小鼠血浆MCP-5和MCSF的表达。11.IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与IL-1α、IL-15、MCP-5、MCSF水平相关性IgD-Fc-Ig组小鼠血浆IgD水平与IL-1α、IL-15水平呈负相关,即血浆IgD水平高IgD-Fc-Ig的给药组,小鼠血浆IL-1α、IL-15水平下降较明显,而与MCP-5、MCSF水平无明显相关性。12.IgD-Fc-Ig对CIA小鼠脾脏Lck、p-Lck、ZAP70、p-ZAP70蛋白表达的影响Lck和ZAP70的总蛋白表达在正常组、模型组以及给药组之间无明显差异,而模型组p-Lck和p-ZAP70的蛋白表达明显升高,IgD-Fc-Ig（3.25,6.5,13mg/kg）剂量组可明显下调CIA小鼠p-Lck和p-ZAP70的蛋白表达。结论:1.IgD可促进RA患者PBMCs的增殖与活化,引起Th17/Treg细胞亚群的失衡,而IgD-Fc-Ig能够下调IgD引起的促细胞增殖、活化作用,恢复IgD所诱导的Th17/Treg细胞亚群的失衡。2.首次揭示IgD-Fc-Ig对实验性关节炎具有治疗作用,改善CIA小鼠的足爪肿胀和病理学改变,CIA小鼠血浆IgD水平明显升高,且IgD-Fc-Ig组血浆IgD水平与关节肿胀数和关节炎指数评分呈负相关,IgD-Fc-Ig抑制T细胞的异常增殖与活化,并逆转Th1/Th2,Th17/Treg细胞亚群的失衡,下调关节炎小鼠炎性细胞因子和趋化因子的水平,这些作用可能与下调Lck和ZAP70的磷酸化有关。3.该研究提示,IgD-IgDR可能成为RA治疗的一个新靶点,IgD-Fc-Ig对伴有高IgD水平RA的治疗可能具有重要前景。