【摘 要】
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目的:构建能高效表达成熟miR-508-5p小分子的慢病毒过表达载体,研究其对MAPK1/ERK信号通路靶向调控作用。方法:利用化学合成miR-508-5p茎环结构RNA,并将其克隆入线性化的pSic
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目的:构建能高效表达成熟miR-508-5p小分子的慢病毒过表达载体,研究其对MAPK1/ERK信号通路靶向调控作用。方法:利用化学合成miR-508-5p茎环结构RNA,并将其克隆入线性化的pSicoR质粒中,经双酶切及测序鉴定;同时构建与miR-508-5p互补靶基因MAPK1的3’非翻译区,将其克隆入线性化的Report载体中。利用脂质体转染试剂将鉴定阳性的pSicoR-miR-508-5p重组质粒转染HEK-293T细胞,进一步通过Relative luciferase activity、Western blot及real-time PCR试验检测MAPK1蛋白和mRNA相对表达水平。结果:酶切及测序结果证明成功构建pSicoR-miR-508-5p及Report-MAPK1 3’-UTR重组质粒,并通过实验证实miR-508-5p过表达明显抑制MAPK1的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P<0.05);抑制miR-508-5p的表达,又明显上调MAPK1的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P<0.05)。结论:成功构建pSicoR-miR-508-5p慢病毒过表达载体,证实miR-508-5p直接靶标MAPK1的表达,在转录后水平对其进行负调控,为进一步研究miRNA对细胞通路和细胞周期的调控作用奠定了基础。
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