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摘要：将ShSAP1的阅读框连接到原核表达载体pET32a（ ）中，构建成ShSAP1原核表达载体PET-ShSAP1，然后将其转入宿主菌BL21，经IPTG诱导后，宿主菌表达出与预期分子量大小相符的35 ku的融合蛋白；将纯化后的融合蛋白免疫家兔，获得了ShSAP1的特异性抗血清；以融合蛋白作抗原，用间接ELISA法测定其抗血清效价为1 ∶25 000。
关键词：甘蔗；ShSAP1；锌指蛋白；原核表达；多克隆抗体
中图分类号： Q331 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0043-03
逆境相关蛋白（stress assiated protein，SAP）是植物中一类含有A20与AN1锌指结构的蛋白，该蛋白家族与植物的非生物胁迫应答密切相关。SAP基因的表达能够被1种或多种非生物胁迫诱导，转基因研究发现SAP家族基因可以增强转基因植物的对1种或多种胁迫的抗逆性[1]。目前关于SAP的作用机制还不是很清楚，研究发现SAP可能通过泛素蛋白酶途径、蛋白相互作用或作为氧化还原感受器参与植物的逆境应答过程[2-4]。ShSAP1（GenBank登录号HM991960.1）是由甘蔗（Saccharum officinarum L.）中克隆到的SAP家族基因，研究发现该基因的表达具有逆境应答特性[5]，目前正在开展ShSAP1的转基因功能分析。本研究构建了ShSAP1的原核表达载体，通过大肠杆菌原核表达系统进行ShSAP1的蛋白表达与纯化，并通过免疫家兔获得了抗血清，为ShSAP1蛋白功能研究及的后续的转基因检测打下了基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
原核表达载体pET32a（ ）由中国热带农业科学院热带生物技术研究所刘志昕实验室惠赠，大肠杆菌菌株DH5α和BL21（DE3）感受态细胞感受态购自天根生化科技有限公司。rTaq酶购自大连宝生物工程有限公司，限制性内切酶，T4连接酶购自Fermantas公司，PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自Axygen公司，蛋白Marker、蛋白纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，Goat Anti-Rabbit IgG-AP与BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，其他试剂为国产分析纯。本试验所用的引物序列如下，由上海生工生物工程技术有限公司合成。
1.2 ShSAP1原核表达载体的构建
由甘蔗cDNA扩增ShSAP1基因阅读框，所用引物为PETZP1和PTEZP2，PCR反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。纯化PCR产物，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对纯化后PCR产物和pET32a（ ）质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物酶切片段和pET32a（ ）大片段，用T4连接酶连接转化DH5α，重组质粒进行酶切验证后送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，获得原核表达载体pET-ShSAP1。
1.3 融合蛋白的小量表达
将pET32a（ ）与测序验证后的原核表达载体pET-ShSAP1转化BL21（DE3），挑取阳性单菌落接种于10 mL含有Amp的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养。培养至D=0.6～0.8，各取1 mL分装于灭菌的1.5 mL EP管中，加等体积35%甘油，混匀，-70 ℃保存。试管中剩余菌液用加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导，37 ℃、200 r/min培养 3～4 h。超声波破碎菌体，取1.5 mL的EP管，分别取1 mL破碎后的菌液，12 000 r/min离心1 min。沉淀用100 μL的无菌水吹散。分别取10 μL上清和10 μL沉淀悬浮液进行 SDS-PAGE 分析，考馬斯亮蓝R-250染色30 min后进行脱色，鉴定表达产物的存在形式及表达量。
1.4 融合蛋白的大量表达与纯化
将小量表达验证过的pET32a（ ）和pET-ShSAP1菌液进行划线培养，挑取阳性单菌落接种于10 mL含有Amp的LB液体培养基中，于37 ℃活化培养8 h后，以1 ∶100稀释到400 mL含有Amp的LB液体培养基中，振荡培养至D600 nm值达到0.6～0.8，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，继续于 37 ℃ 培养8 h诱导蛋白表达。8 000 r/min离心10 min，收集菌体，弃上清，加入30 mL Binding Buffer（500 mmol/L NaCl、20 mmol/L imidazole、10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）重悬，使用超声波破碎法在冰浴中对菌体进行破碎，8 000 r/min离心10 min，分离裂解液上清保存，取10 μL上清液进行SDS-PAGE分析。
蛋白纯化：用6 mL灭菌水洗涤琼脂糖树脂2次后，以 6 mL Binding Buffer平衡亲和柱。取6 mL裂解液上清上柱，用6 mL Wash Buffer（500 mmol/L NaCl、20 mmol/L imidazole、20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）洗脱杂蛋白，再分别以由低至高的咪唑浓度的6 mL Elute Buffer（500 mmol/L NaCl，50、100、200、500 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）洗脱融合蛋白，取10 μL洗脱液进行SDS-PAGE分析。同时，将纯化蛋白送往北京华大基因测序中心进行质谱测序分析。选取浓度与纯度较好的洗脱液进行1×PBS透析，透析3次后进行蛋白浓度测定既可用于免疫兔子，蛋白浓度（mg/mL）=1.45D280 nm-0.74D260 nm[6]。 1.5 抗血清的制备和效价测定
将纯化并透析过的融合蛋白作为免疫原对普通成年大白兔进行免疫（注射总量为1 800 μg/只），每次免疫加等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射。每隔8 d 进行1次免疫，第4次免疫后第5天耳静脉采血，分离血清，以ShSAP1纯化融合蛋白（2 μg/mL）为抗原进行ID-ELISA 测定，以免疫前家兔血清作为阴性对照，PBS作为空白对照。效价检测合格后进行颈动脉采全血50 mL，血液处理如下：37 ℃静置1 h，4 ℃ 静置过夜，5 000 r/min离心15 min，吸取上清于50 mL离心管，再次5 000 r/min离心，15 min，吸取上清，留出近期使用量2～8 ℃存放，其余分装后置于-70 ℃。
2 结果与分析
2.1 ShSAP1的原核表达的构建
用引物PETZP1与PETZP2从甘蔗cDNA扩增得到带有BamHⅠ/HindⅢ酶切位点的530 bp目标产物（图1泳道1），将PCR产物纯化后和载体pET32a（ ）分别进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切，回收PCR酶切产物和pET32a（ ）大片段进行连接转化DH5a，对重组质粒进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切验证，可以切下530 bp左右的目的条带（图1泳道3）载体经测序鉴定后，结果正确，构建成ShSAP1的原核表达载体pET-ShSAP1。
2.2 ShSAP1的小量表达与表达模式的确定
将pET32a（ ）与pET-ShSAP1重组子质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选出阳性克隆，小量培养至D值为0.7左右，加IPTG诱导3 h，收集菌体进行超声波破碎细胞后，离心分出上清与沉淀，分别取10 μl上清和10 μl沉淀悬浮液进行SDS-PAGE电泳（图2），pET-ShSAP1菌体裂解液上清在约35 ku处出现1条蛋白带，而对照pET32a（ ）上清无此带。ShSAP1基因编码171个氨基酸，预测蛋白分子量约为18.3 ku，融合蛋白的氨基酸总数为332个左右，表达出的融合蛋白ShSAP1-His大小约为35 ku，大小与SDS-PAGE所测大小相符，初步表明ShSAP1在大肠杆菌中表达成功。ShSAP1在（http：//www.expasy.ch/tools）疏水性分析结果表明，ShSAP1编码的氨基酸序列中，具有多个明显的亲水区域，大部分的氨基酸属于亲水性氨基酸，推测ShSAP1属于亲水性蛋白；由pET-ShSAP1的菌体裂解液沉淀悬浮液的电泳结果可以说明，ShSAP1-His融合蛋白主要存在于上清中，确定ShSAP1为可溶性蛋白。
2.3 ShSAP1的大量表达及纯化
经过大量诱导，PET-ShSAP1菌表達出了丰度较高的目标融合蛋白（图3泳道2）。将ShSAP1的粗蛋白上清用 Ni2 -NTA 琼脂糖亲和层析柱进行纯化，其中Elute Buffer的imidazole浓度为100 mmol/L时洗脱纯度和浓度较好，以该浓度下的洗脱产物进行电泳（图3泳道3），测定纯化后的表达产物浓度为0.805 mg/mL。将纯化蛋白条带切下送往华大基因测序，质谱所得部分氨基酸序列经比对后发现与甘蔗ShSAP1推导蛋白氨基酸序列具有一致性，说明ShSAP1在大肠杆菌中得到了正确的表达。
2.4 ShSAP1抗血清的效价测定
将纯化后并经过透析的融合蛋白（0.673 mg/mL）作为免疫原，采用肌肉与皮下注射相结合免疫家兔，4次注射后进行抗血清的效价测定。以蛋白溶液（2 μg/mL）为抗原进行 ID-ELISA 测定（图4），以表达的ShSAP1融合蛋白作抗原，抗血清稀释125 000倍后仍明显地呈阳性反应。效价判断标准为大于最大D405 nm的一半的最小D405 nm所对应的稀释度，即为1 ∶25 000。
3 讨论
植物对逆境的适应主要依靠激活抗逆相关调控因子如DREB、MYB/MYC、NAC、AREB等转录因子[7]，激活下游的抗逆效应基因，这些基因可能是抗逆代谢途径中的关键酶如SOD、POD[8]，也可能是直接起作用的抗逆效应蛋白如热激蛋白等[9]。有研究表明一些抗逆基因能够提高原核表达重组菌的抗胁迫能力[10-12]。ShSAP1的表达能被高盐诱导，在进行ShSAP1融合蛋白抗血清制备的同时，我们通过在培养基和培养平板中添加不同浓度的NaCl对pET-ShSAP1重组菌进行了抗盐性鉴定，结果未发现该重组菌表现出抗盐特征，说明ShSAP1在BL21原核系统中无增强宿主菌抗盐胁迫的能力，可能是由BL21中没有与ShSAP1相互作用的抗逆应答因子所致。本研究对甘蔗ShSAP1进行了原核表达与蛋白纯化，得到了与预期蛋白大小一致的融合蛋白，并制备了ShSAP1的抗血清，为今后转基因植株检测和蛋白质功能研究奠定了基础.
参考文献：
[1]Giri J，Dansana P K，Kothari K S，et al. SAPs as novel regulators of abiotic stress response in plants[J]. Bioessays，2013，35（7）：639-648.
[2]Giri J，Vij S，Dansana P K，et al. Rice a20/AN1 zinc-finger containing stress-associated proteins （SAP1/11）and a receptor-like cytoplasmic kinase （OsRLCK253）interact via a20 zinc-finger and confer abiotic stress tolerance in transgenic arabidopsis plants[J]. New Phytologist，2011，191（3）：721-732. [3]Kang M，Fokar M，Abdelmageed H，et al. Arabidopsis SAP5 functions as a positive regulator of stress responses and exhibits E3 ubiquitin ligase activity[J]. Plant Molecular Biology，2011，75（4/5）：451-466.
[4]Strher E，Wang X J，Roloff N，et al. Redox-dependent regulation of the stress-induced zinc-finger protein SAP12 in Arabidopsis thaliana[J]. Molecular plant，2009，2（2）：357-367.
[5]李晓君，蔡文伟，张树珍，等. 甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1的克隆与表达模式[J]. 生物工程学报，2011，27（6）：868-875.
[6]吴育鹏，王健华，冯团诚，等. 辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备[J]. 园艺学报，2010，37（10）：1598-1604.
[7]Nakashima K，Ito Y，Yamaguchi-Shinozaki K. Transcriptional regulatory networks in response to abiotic stresses in arabidopsis and grasses[J]. Plant Physiology，2009，149（1）：88-95.
[8]Apel K，Hirt H. Reactive oxygen species：metabolism，oxidative stress，and signal transduction[J]. Annual Review of Plant Biology，2004，55：373-399.
[9]Wang W，Vinocur B，Shoseyov O，et al. Role of plant heatshock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response[J]. Trends in Plant Science，2004，9：244-252.
[10]臧 潔，余 梅，王先磊，等. 盐角草Cu/Zn-SOD基因的克隆及耐盐性分析[J]. 农业生物技术学报，2013，21（7）：847-854.
[11]蔡 丹，郑易之，兰 英. 大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和烟草耐盐性[J]. 深圳大学学报，2006，23（3）：230-236.
[12]郝梦雨，郎明林，杨学举. 印度芥菜BjJ10-2基因原核表达载体构建及抗盐功能的鉴定[J]. 核农学报，2011，25（2）：247-252.
关键词：甘蔗；ShSAP1；锌指蛋白；原核表达；多克隆抗体
中图分类号： Q331 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0043-03
逆境相关蛋白（stress assiated protein，SAP）是植物中一类含有A20与AN1锌指结构的蛋白，该蛋白家族与植物的非生物胁迫应答密切相关。SAP基因的表达能够被1种或多种非生物胁迫诱导，转基因研究发现SAP家族基因可以增强转基因植物的对1种或多种胁迫的抗逆性[1]。目前关于SAP的作用机制还不是很清楚，研究发现SAP可能通过泛素蛋白酶途径、蛋白相互作用或作为氧化还原感受器参与植物的逆境应答过程[2-4]。ShSAP1（GenBank登录号HM991960.1）是由甘蔗（Saccharum officinarum L.）中克隆到的SAP家族基因，研究发现该基因的表达具有逆境应答特性[5]，目前正在开展ShSAP1的转基因功能分析。本研究构建了ShSAP1的原核表达载体，通过大肠杆菌原核表达系统进行ShSAP1的蛋白表达与纯化，并通过免疫家兔获得了抗血清，为ShSAP1蛋白功能研究及的后续的转基因检测打下了基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
原核表达载体pET32a（ ）由中国热带农业科学院热带生物技术研究所刘志昕实验室惠赠，大肠杆菌菌株DH5α和BL21（DE3）感受态细胞感受态购自天根生化科技有限公司。rTaq酶购自大连宝生物工程有限公司，限制性内切酶，T4连接酶购自Fermantas公司，PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自Axygen公司，蛋白Marker、蛋白纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，Goat Anti-Rabbit IgG-AP与BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，其他试剂为国产分析纯。本试验所用的引物序列如下，由上海生工生物工程技术有限公司合成。
1.2 ShSAP1原核表达载体的构建
由甘蔗cDNA扩增ShSAP1基因阅读框，所用引物为PETZP1和PTEZP2，PCR反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。纯化PCR产物，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ对纯化后PCR产物和pET32a（ ）质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收PCR产物酶切片段和pET32a（ ）大片段，用T4连接酶连接转化DH5α，重组质粒进行酶切验证后送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，获得原核表达载体pET-ShSAP1。
1.3 融合蛋白的小量表达
将pET32a（ ）与测序验证后的原核表达载体pET-ShSAP1转化BL21（DE3），挑取阳性单菌落接种于10 mL含有Amp的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养。培养至D=0.6～0.8，各取1 mL分装于灭菌的1.5 mL EP管中，加等体积35%甘油，混匀，-70 ℃保存。试管中剩余菌液用加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导，37 ℃、200 r/min培养 3～4 h。超声波破碎菌体，取1.5 mL的EP管，分别取1 mL破碎后的菌液，12 000 r/min离心1 min。沉淀用100 μL的无菌水吹散。分别取10 μL上清和10 μL沉淀悬浮液进行 SDS-PAGE 分析，考馬斯亮蓝R-250染色30 min后进行脱色，鉴定表达产物的存在形式及表达量。
1.4 融合蛋白的大量表达与纯化
将小量表达验证过的pET32a（ ）和pET-ShSAP1菌液进行划线培养，挑取阳性单菌落接种于10 mL含有Amp的LB液体培养基中，于37 ℃活化培养8 h后，以1 ∶100稀释到400 mL含有Amp的LB液体培养基中，振荡培养至D600 nm值达到0.6～0.8，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，继续于 37 ℃ 培养8 h诱导蛋白表达。8 000 r/min离心10 min，收集菌体，弃上清，加入30 mL Binding Buffer（500 mmol/L NaCl、20 mmol/L imidazole、10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）重悬，使用超声波破碎法在冰浴中对菌体进行破碎，8 000 r/min离心10 min，分离裂解液上清保存，取10 μL上清液进行SDS-PAGE分析。
蛋白纯化：用6 mL灭菌水洗涤琼脂糖树脂2次后，以 6 mL Binding Buffer平衡亲和柱。取6 mL裂解液上清上柱，用6 mL Wash Buffer（500 mmol/L NaCl、20 mmol/L imidazole、20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）洗脱杂蛋白，再分别以由低至高的咪唑浓度的6 mL Elute Buffer（500 mmol/L NaCl，50、100、200、500 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0）洗脱融合蛋白，取10 μL洗脱液进行SDS-PAGE分析。同时，将纯化蛋白送往北京华大基因测序中心进行质谱测序分析。选取浓度与纯度较好的洗脱液进行1×PBS透析，透析3次后进行蛋白浓度测定既可用于免疫兔子，蛋白浓度（mg/mL）=1.45D280 nm-0.74D260 nm[6]。 1.5 抗血清的制备和效价测定
将纯化并透析过的融合蛋白作为免疫原对普通成年大白兔进行免疫（注射总量为1 800 μg/只），每次免疫加等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射。每隔8 d 进行1次免疫，第4次免疫后第5天耳静脉采血，分离血清，以ShSAP1纯化融合蛋白（2 μg/mL）为抗原进行ID-ELISA 测定，以免疫前家兔血清作为阴性对照，PBS作为空白对照。效价检测合格后进行颈动脉采全血50 mL，血液处理如下：37 ℃静置1 h，4 ℃ 静置过夜，5 000 r/min离心15 min，吸取上清于50 mL离心管，再次5 000 r/min离心，15 min，吸取上清，留出近期使用量2～8 ℃存放，其余分装后置于-70 ℃。
2 结果与分析
2.1 ShSAP1的原核表达的构建
用引物PETZP1与PETZP2从甘蔗cDNA扩增得到带有BamHⅠ/HindⅢ酶切位点的530 bp目标产物（图1泳道1），将PCR产物纯化后和载体pET32a（ ）分别进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切，回收PCR酶切产物和pET32a（ ）大片段进行连接转化DH5a，对重组质粒进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切验证，可以切下530 bp左右的目的条带（图1泳道3）载体经测序鉴定后，结果正确，构建成ShSAP1的原核表达载体pET-ShSAP1。
2.2 ShSAP1的小量表达与表达模式的确定
将pET32a（ ）与pET-ShSAP1重组子质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选出阳性克隆，小量培养至D值为0.7左右，加IPTG诱导3 h，收集菌体进行超声波破碎细胞后，离心分出上清与沉淀，分别取10 μl上清和10 μl沉淀悬浮液进行SDS-PAGE电泳（图2），pET-ShSAP1菌体裂解液上清在约35 ku处出现1条蛋白带，而对照pET32a（ ）上清无此带。ShSAP1基因编码171个氨基酸，预测蛋白分子量约为18.3 ku，融合蛋白的氨基酸总数为332个左右，表达出的融合蛋白ShSAP1-His大小约为35 ku，大小与SDS-PAGE所测大小相符，初步表明ShSAP1在大肠杆菌中表达成功。ShSAP1在（http：//www.expasy.ch/tools）疏水性分析结果表明，ShSAP1编码的氨基酸序列中，具有多个明显的亲水区域，大部分的氨基酸属于亲水性氨基酸，推测ShSAP1属于亲水性蛋白；由pET-ShSAP1的菌体裂解液沉淀悬浮液的电泳结果可以说明，ShSAP1-His融合蛋白主要存在于上清中，确定ShSAP1为可溶性蛋白。
2.3 ShSAP1的大量表达及纯化
经过大量诱导，PET-ShSAP1菌表達出了丰度较高的目标融合蛋白（图3泳道2）。将ShSAP1的粗蛋白上清用 Ni2 -NTA 琼脂糖亲和层析柱进行纯化，其中Elute Buffer的imidazole浓度为100 mmol/L时洗脱纯度和浓度较好，以该浓度下的洗脱产物进行电泳（图3泳道3），测定纯化后的表达产物浓度为0.805 mg/mL。将纯化蛋白条带切下送往华大基因测序，质谱所得部分氨基酸序列经比对后发现与甘蔗ShSAP1推导蛋白氨基酸序列具有一致性，说明ShSAP1在大肠杆菌中得到了正确的表达。
2.4 ShSAP1抗血清的效价测定
将纯化后并经过透析的融合蛋白（0.673 mg/mL）作为免疫原，采用肌肉与皮下注射相结合免疫家兔，4次注射后进行抗血清的效价测定。以蛋白溶液（2 μg/mL）为抗原进行 ID-ELISA 测定（图4），以表达的ShSAP1融合蛋白作抗原，抗血清稀释125 000倍后仍明显地呈阳性反应。效价判断标准为大于最大D405 nm的一半的最小D405 nm所对应的稀释度，即为1 ∶25 000。
3 讨论
植物对逆境的适应主要依靠激活抗逆相关调控因子如DREB、MYB/MYC、NAC、AREB等转录因子[7]，激活下游的抗逆效应基因，这些基因可能是抗逆代谢途径中的关键酶如SOD、POD[8]，也可能是直接起作用的抗逆效应蛋白如热激蛋白等[9]。有研究表明一些抗逆基因能够提高原核表达重组菌的抗胁迫能力[10-12]。ShSAP1的表达能被高盐诱导，在进行ShSAP1融合蛋白抗血清制备的同时，我们通过在培养基和培养平板中添加不同浓度的NaCl对pET-ShSAP1重组菌进行了抗盐性鉴定，结果未发现该重组菌表现出抗盐特征，说明ShSAP1在BL21原核系统中无增强宿主菌抗盐胁迫的能力，可能是由BL21中没有与ShSAP1相互作用的抗逆应答因子所致。本研究对甘蔗ShSAP1进行了原核表达与蛋白纯化，得到了与预期蛋白大小一致的融合蛋白，并制备了ShSAP1的抗血清，为今后转基因植株检测和蛋白质功能研究奠定了基础.
参考文献：
[1]Giri J，Dansana P K，Kothari K S，et al. SAPs as novel regulators of abiotic stress response in plants[J]. Bioessays，2013，35（7）：639-648.
[2]Giri J，Vij S，Dansana P K，et al. Rice a20/AN1 zinc-finger containing stress-associated proteins （SAP1/11）and a receptor-like cytoplasmic kinase （OsRLCK253）interact via a20 zinc-finger and confer abiotic stress tolerance in transgenic arabidopsis plants[J]. New Phytologist，2011，191（3）：721-732. [3]Kang M，Fokar M，Abdelmageed H，et al. Arabidopsis SAP5 functions as a positive regulator of stress responses and exhibits E3 ubiquitin ligase activity[J]. Plant Molecular Biology，2011，75（4/5）：451-466.
[4]Strher E，Wang X J，Roloff N，et al. Redox-dependent regulation of the stress-induced zinc-finger protein SAP12 in Arabidopsis thaliana[J]. Molecular plant，2009，2（2）：357-367.
[5]李晓君，蔡文伟，张树珍，等. 甘蔗锌指蛋白基因ShSAP1的克隆与表达模式[J]. 生物工程学报，2011，27（6）：868-875.
[6]吴育鹏，王健华，冯团诚，等. 辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备[J]. 园艺学报，2010，37（10）：1598-1604.
[7]Nakashima K，Ito Y，Yamaguchi-Shinozaki K. Transcriptional regulatory networks in response to abiotic stresses in arabidopsis and grasses[J]. Plant Physiology，2009，149（1）：88-95.
[8]Apel K，Hirt H. Reactive oxygen species：metabolism，oxidative stress，and signal transduction[J]. Annual Review of Plant Biology，2004，55：373-399.
[9]Wang W，Vinocur B，Shoseyov O，et al. Role of plant heatshock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response[J]. Trends in Plant Science，2004，9：244-252.
[10]臧 潔，余 梅，王先磊，等. 盐角草Cu/Zn-SOD基因的克隆及耐盐性分析[J]. 农业生物技术学报，2013，21（7）：847-854.
[11]蔡 丹，郑易之，兰 英. 大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和烟草耐盐性[J]. 深圳大学学报，2006，23（3）：230-236.
[12]郝梦雨，郎明林，杨学举. 印度芥菜BjJ10-2基因原核表达载体构建及抗盐功能的鉴定[J]. 核农学报，2011，25（2）：247-252.