论文部分内容阅读
摘 要：分子生物学检测方法以其高效、灵敏、准确、快速的特点在食品行业真伪辨别中备受欢迎。该文主要介绍了燕窝检测中的聚合酶链式反应、实时荧光PCR、分子指纹、基因芯片、基因测序等基因检测技术研究现状，为后续燕窝真伪鉴别提供参考依据。
关键词：燕窝;分子生物;真伪鉴别
中图分类号 TS207 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）20-0018-04
Research Progress on Molecular Biology Detection Technology of Edible Bird′s Nest
BAI Weijuan1 et al.
（1Yan Palace Seelong Food Co.， Ltd.， Nest Technology Center， Xiamen 361100， China）
Abstract： Molecular biology detection methods are popular in the authenticity identification of the food industry due to their high efficiency， sensitivity， accuracy and speed. This article mainly introduces the polymerase chain reaction，real-time fluorescent PCR， molecular fingerprinting， gene chip， gene sequencing and other gene detection technologies in bird′s nest detection， and provides a reference for subsequent identification of edible bird nest authenticity.
Key words： Edible bird′s nest （EBN）; Molecular biology; Authentication
燕窩（edible bird′s nest，EBN）由金丝燕属（Aerodramus）和侏金丝燕属（Collocalia）7种小型鸟组成，在繁殖过程中唾液腺分泌物与羽毛或草混合而成[1]。金丝雀的生长和繁殖需要具备充足的食物来源、约90%湿度及28～30℃温度的适宜环境条件[2]。因此，金丝雀仅分布在条件适宜的地区，如印度尼西亚、马来西亚、泰国、越南等国家。随着经济水平的提高，加上疫情下国民对大健康的重视，燕窝市场呈现逆势上扬的趋势。中国市场流通的燕窝100%依赖进口，2020年度我国进口燕窝量高达345t，同比2017年进口量81.4t，增加了4倍。2020年天猫购物平台燕窝类销售额约为44.5亿元，同比2019年增长39%。燕窝具有丰富的营养价值，具有提高婴儿智力和记忆力[3]、抗病毒[4-5]、抗氧化[6-7]、抗肿瘤[8]、提高人体免疫力[9-12]、抗凝血[13]、改善皮肤[14]等功能。在中国人长期的认知中，食用燕窝已经成为一种健康的饮食习惯。因此，随着生活水平的逐步提高，人们对燕窝的需求量也在增加。但由于产量减少而利润丰厚，市场上充斥着掺假品和低质量的燕窝，且由于国内外缺乏有关燕窝质量的法规和标准，使有效市场监控变得十分困难。无休止的非法手段，例如掺假或染色等，使市场陷入恶性竞争圈。消费者对燕窝缺乏常识，很容易被不道德的商人和不负责任的舆论所误导。N-乙酰基神经氨酸（唾液酸）是由金丝燕口腔上皮细胞及其绒羽组成，作为燕窝中主要生物活性成分，其可提供相关生物信息，可作为判断真假及品质好坏的依据。
基因是带有遗传信息的DNA片段，具有物质性（存在方式）和信息性（根本属性）双重属性，因此利用基因手段对生物物种进行鉴定是科学可靠的。随着生物学的快速发展，基因检测方法不断涌现，如PCR技术、基因测序、基因图谱、基因芯片、分子指纹等。分子生物学检测手段以其高灵敏度、快速方便、特异性好等特点，在燕窝制品真伪鉴别中得到了广泛应用。燕窝主要是由唾液酸糖蛋白组成，其水体液中发现多种主要以黏蛋白形式存在的水溶性蛋白，不易分离纯化。研究发现，利用液相等点聚焦电泳，使燕窝水提蛋白质后再用丙酮沉淀能有效去除其杂质分离效果更好，适用于电泳分析试验[15]。同时，也有研究报道关于燕窝中的蛋白质的制备方法，利用80%丙酮来沉淀蛋白质可有效去除杂质，使其分离效果更佳[16]。刘鸣畅等[17]研究表明，毛细管凝胶电泳技术适用于掺假燕窝中银耳成分得检测。刁雅欣等[18]通过提取燕窝DNA基因，利用动物类通用COI基因进行PCR扩增，建立了NJ系统发育树，对13个样本进行了鉴别分析，其中13个样品与Aerodramus fuciphagus的COI DNA序列相似度高于99%，说明DNA条形码技术可作为燕窝基源判断技术之一。王凤云等[19]对不同品种及产地燕窝提取其DNA，利用ND2序列进行扩增测序，构建了NJ系统发育树，结果表明，市场上官燕的均为爪哇金丝燕（Aerodramus fuciphagus）或其亚种A. fuciphagus germani，为后续生物鉴别研究奠定了基础。
1 PCR技术在燕窝中应用
PCR技术模拟DNA天然复制过程，在体外DNA的特异序列进行扩增，从而获得大量的同一序列。与扩增特异性密切相关的因素是与待扩增的特异序列两端互补的2个寡核苷酸引物（上游引物和下游引物）。该技术是基因扩增技术的一次重大改革，是分子生物学发展史中的一个重要里程碑，经过一系列研究产生了限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术、原位PCR技术、多重PCR技术、巢式PCR（NEST PCR）技术、反向PCR（Inverse PCR，IPCR）技术、锚定PCR（Anchored PCR，APCR）技术、反转录PCR（reverse transcription，RT-PCR）技术、修饰引物PCR技术、等位基因特异性PCR（Allele-specific PCR，ASPCR）技术、单链构型多肽性PCR（single-strandconformational polymorphism PCR，SSCPPCR）技术、竞争性PCR（competitive PCR，c-PCR）技术、差示PCR（differential PCR，d-PCR）技术等技术在检测方面的运用。RT-PCR技术的产生使PCR技术产生了质飞跃，其最主要特点是定量范围宽、灵敏度高，并能同时处理多个样本。 Liu等[20]收集了来自42个不同地区的燕窝样本，通过测序分析和系统发育分类，初步确定其来源，在对该物种的限制图谱分析中发现2个稳定的酶消化位点，最后建立了快速及特异性强的限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）方法来鉴定燕窝样品的来源。陈筱婷[21]建立了多重RT-PCR对燕窝中主要成分及其掺假成分进行检测，可以特异性地检测燕窝中金丝燕、银耳、红藻和石花菜成分，其特异性强、灵敏度高，可作为燕窝及其制品掺假的定性鉴别。刘敬等[22]采集了25份未经加工的东南亚燕窝的12S rRNA和Cytb基因序列通过分析，利用直接提取的燕窝DNA模板，然后重新设计了12S rRNA和Cytb基因序列，并进行相关克隆测序，结果表明扩增的均正确来自其对应的线粒体基因序列。Meei等[23]基于线粒体和核DNA序列的核苷酸测序（FINS）技术，建立了一种快速且经济有效的SYBR green I的实时荧光定量检测方法，可用于燕窝真伪鉴别。陈月娟等[24]从马来西亚、印度尼西亚、越南和泰国收集了39个燕窝样本，提取了用于PCR反应的基因组DNA并对扩增产物进行了测序，结果表明39种样品来自3种燕窝。通过NJ和UPMGA系统发育树可以成功地区分样品，这意味着cytb序列可用于区分燕窝的起源，并且可以有效地追踪燕窝的起源物种。Lv等[25]基于遗传信息和变态扩增系统（ARMS-PCR）建立了一种快速、简单、准确的燕窝基因鉴定方法。Quek等[26]基于线粒体和核DNA序列的遗传信息核苷酸测序技术，并进行了系统发育分析来确定燕窝类型和来源，结果表明，Cytb、ND2、12S核糖体RNA和β-纤维蛋白原内含子7基因标记可以有效地区分A. fuciphagus和A. maximus。此外，通过对线粒体cytb和ND2基因进行测序，可以有效地区分屋燕和洞燕。
2 DNA指纹技术
DNA指纹技术（DNA fingerprint technique）是分子生物学中一种新技术，在生物组织中提取DNA片段后进行PCR扩增出完整的基因组的DNA，然后酶切成DNA片段，进行SDS电泳根据分子量大小进行分离。DNA指纹技术包括：限制性酶切片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性（RAPD）、微卫星技术又称简单重复序列（SSR）、核糖体脱氧核糖核酸（rDNA）序列分析、扩增片段长度多态性（AFLP）和单核苷酸多态性（SNP）等。
DNA指纹技术的主要特点如下：（1）简单的遗传方式，遵循简单的孟德尔遗传方式;（2）高度变异性，不同的个体或群体有不同的DNA指纹图且存在差异;（3）多位点性，可以同时检测基因组中数十个位点的变异性;（4）不受外界因素的干扰;（5）不受种类组织差异、不同生长阶段等的影响;（6）有许多标记表现为共显性，能鉴别纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息;（7）信息量大，高分辨率;（8）技术段简单、快速、自动化程度高;（9）提取的样本在适合环境下能够长期存储，有利于数据溯源追踪或仲裁性鉴定等。因此，DNA指纹技术可用于中草药鉴别、真菌分类上应用、畜禽亲缘系统分类应用、法医学鉴定应用、样品的真伪鉴别、掺假鉴定及珍贵产品的溯源等。
John等[27]利用信息丰富的SNP标记对越南的1570个木薯克隆进行了分子分析，揭示了农民田间和种质库中的品种组成，可用于异地品质木薯的筛选。Schüller等[28]利用2个多重PCR反应中优化的11个SSR标记对63份樱桃进行基因分型，鉴定出38个不同等位型，平均每个位点检测到6.3个等位基因，PIC值为0.59。此外，利用8个选择性引物组合衍生的223个AFLP标记进一步区分17份亲缘关系较近的樱桃，结果表明：SSR指纹图谱可用于樱桃的种类鉴定;崔学强等[29]利用ISSR分子标记技术对22中石斛兰进行了亲缘关系及遗传多样性的检测分析，结果表明22种石斛兰表现出丰富的遗传多样性，构建的DNA指纹图谱可鉴别出22种石斛兰，可为石斛兰品质资源鉴定、杂交育种亲本选择等提供可靠的依据及帮助。李涛等[30]通过建立核磁共振氢谱（1H-NMR）指纹图谱技术结合多元统计分析方法对不同产地的大花红景进行有效分类和不同产地的鉴别。付涛等[31]利用EST-SSR对铁皮石斛近原物种进行了EST序列开发，结果表明，43对引物可以擴增出清晰谱带、多态性较好的条带，为有效鉴别铁皮石斛品种、种质资源、遗传谱图的建立等提供理论依据。Sunar等[32]采用ISSR和RAPD分析技术对15个丹参种间的亲缘关系进行了研究，发现物种间的相似性介于0.54～0.93，表明这2个标记是评价丹参物种间遗传多样性和亲缘关系的可靠手段，为后续丹参种间的亲缘关系鉴定奠定了基础。史中飞等[33]利用PCR-RFLP对当归中掺入的欧当归进行进行研究，结果表明，PCR-RFLP鉴别方法能够快速、准确、灵敏应用于当归药材及其饮片中是否掺入欧当归，为当归的品质提供了可靠的检测手段，进一步为其临床应用保驾护航。
虽然DNA指纹技术已在食品生物源性方面被广泛研究与应用，但是目前将该技术应用于燕窝及其制品的鉴定溯源等研究，国内外相关报道较为罕见。其主要原因可能是燕窝及其制品成为产品前需要经过多道工序的加工处理，在加工过程中燕窝部分DNA出现了较多降解，不易提取纯化，富集的DNA片段可能多为小分子片段，所以建立燕窝特异性DNA指纹图片难度较大。但是，可对燕窝的掺假鉴定及其产地溯源进行多方面研究，可快速准确的鉴别掺假燕窝，给企业选择优良的燕窝产地及燕窝原料提供方向，以期为提高市场上燕窝的品质提供有效的支撑。
3 基因芯片技术
基因芯片技术（gene chip technology，GCT），又称DNA微阵列、寡核苷酸微芯片或寡核苷酸阵列，是生物芯片中极为重要的一种，也是其发展的重点技术之一。基因芯片诞生于20世纪的一项新技术，与过去的研究方法对比，基因芯片特点主要显现在其高度并行性、高度自动化、多样性和微型化，是一种获得大量微生物信息的可靠技术[341-35]。基因芯片原理是通过基因探针结合核酸杂交技术，以经过特殊处理的硅片、玻片、硝酸纤维膜等为载体，将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于其上，根据碱基互补配对原则与荧光标记法或同位素标记过的样品进行多元杂交，利用杂交信号的强弱及分布，来分对照析目的分子的有无、数量及序列，以次测出受检样品的遗传信息，最终由计算机软件进行自动化分析、解读完成结果的定性或定量试验。基因芯片的主要类型有无机片基和有机合成物的基因芯片、原位合成和预先合成然后点样的基因芯片。 [29]崔学强，唐璇，黄昌艳，等.22种石斛兰遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建[J].分子植物育种，2021（09）：3005-3014.
[30]李涛，司梦鑫，李冲.1H-NMR指纹图谱技术结合多元统计分析鉴别不同产地的大花红景天[J].中药材，2018，041（010）：2290-2295.
[31]付涛，胡仲义，何月秋，等.铁皮石斛EST-SSR分子标记的开发[J].核农学報，2017（4）：663-670.
[32]Sunar S，Korkmaz M，Simaz B，et al. Determination of the Genetic Relationships Among Salvia Species by RAPD and ISSR Analyses[J].Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences，2020，17（5）：480-485.
[33]史中飞，滕宝霞，赖晶，等.PCR-RFLP鉴别当归药材及饮片中掺混伪品——欧当归的方法[J].中国实验方剂学杂志，2021，27（9）：168-175.
[34]Jung HY，Han HS，Kim HB，et al. Comparison of analytical and clinical performance of HPV 9G DNA Chip，PANArray HPV genotyping chip，and hybrid-capture II assay in cervicovaginal Swabs[J].J Pathol Transl Med，2016，50：138-146.
[35]Li Q，Wu C，Song G，et al. Genome-Wide analysis of long noncoding RNA expression profiles in human xuanwei lung cancer[J].Clin Lab，2015，61（10）：1515-1523.
[36]J，Abdullah，N，et al. Rapid detection of Salmonella Typhi by loop-mediated isothermal amplification （LAMP） method.[J].Brazilian journal of microbiology ： publication of the Brazilian Society for Microbiology，2014，45（4）：1385-1391.
[37]祝儒刚，李拖平，宋立峰.应用基因芯片技术检测肉及肉制品中5种致病菌[J].食品科学，2012，033（014）：211-215.
关键词：燕窝;分子生物;真伪鉴别
中图分类号 TS207 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2021）20-0018-04
Research Progress on Molecular Biology Detection Technology of Edible Bird′s Nest
BAI Weijuan1 et al.
（1Yan Palace Seelong Food Co.， Ltd.， Nest Technology Center， Xiamen 361100， China）
Abstract： Molecular biology detection methods are popular in the authenticity identification of the food industry due to their high efficiency， sensitivity， accuracy and speed. This article mainly introduces the polymerase chain reaction，real-time fluorescent PCR， molecular fingerprinting， gene chip， gene sequencing and other gene detection technologies in bird′s nest detection， and provides a reference for subsequent identification of edible bird nest authenticity.
Key words： Edible bird′s nest （EBN）; Molecular biology; Authentication
燕窩（edible bird′s nest，EBN）由金丝燕属（Aerodramus）和侏金丝燕属（Collocalia）7种小型鸟组成，在繁殖过程中唾液腺分泌物与羽毛或草混合而成[1]。金丝雀的生长和繁殖需要具备充足的食物来源、约90%湿度及28～30℃温度的适宜环境条件[2]。因此，金丝雀仅分布在条件适宜的地区，如印度尼西亚、马来西亚、泰国、越南等国家。随着经济水平的提高，加上疫情下国民对大健康的重视，燕窝市场呈现逆势上扬的趋势。中国市场流通的燕窝100%依赖进口，2020年度我国进口燕窝量高达345t，同比2017年进口量81.4t，增加了4倍。2020年天猫购物平台燕窝类销售额约为44.5亿元，同比2019年增长39%。燕窝具有丰富的营养价值，具有提高婴儿智力和记忆力[3]、抗病毒[4-5]、抗氧化[6-7]、抗肿瘤[8]、提高人体免疫力[9-12]、抗凝血[13]、改善皮肤[14]等功能。在中国人长期的认知中，食用燕窝已经成为一种健康的饮食习惯。因此，随着生活水平的逐步提高，人们对燕窝的需求量也在增加。但由于产量减少而利润丰厚，市场上充斥着掺假品和低质量的燕窝，且由于国内外缺乏有关燕窝质量的法规和标准，使有效市场监控变得十分困难。无休止的非法手段，例如掺假或染色等，使市场陷入恶性竞争圈。消费者对燕窝缺乏常识，很容易被不道德的商人和不负责任的舆论所误导。N-乙酰基神经氨酸（唾液酸）是由金丝燕口腔上皮细胞及其绒羽组成，作为燕窝中主要生物活性成分，其可提供相关生物信息，可作为判断真假及品质好坏的依据。
基因是带有遗传信息的DNA片段，具有物质性（存在方式）和信息性（根本属性）双重属性，因此利用基因手段对生物物种进行鉴定是科学可靠的。随着生物学的快速发展，基因检测方法不断涌现，如PCR技术、基因测序、基因图谱、基因芯片、分子指纹等。分子生物学检测手段以其高灵敏度、快速方便、特异性好等特点，在燕窝制品真伪鉴别中得到了广泛应用。燕窝主要是由唾液酸糖蛋白组成，其水体液中发现多种主要以黏蛋白形式存在的水溶性蛋白，不易分离纯化。研究发现，利用液相等点聚焦电泳，使燕窝水提蛋白质后再用丙酮沉淀能有效去除其杂质分离效果更好，适用于电泳分析试验[15]。同时，也有研究报道关于燕窝中的蛋白质的制备方法，利用80%丙酮来沉淀蛋白质可有效去除杂质，使其分离效果更佳[16]。刘鸣畅等[17]研究表明，毛细管凝胶电泳技术适用于掺假燕窝中银耳成分得检测。刁雅欣等[18]通过提取燕窝DNA基因，利用动物类通用COI基因进行PCR扩增，建立了NJ系统发育树，对13个样本进行了鉴别分析，其中13个样品与Aerodramus fuciphagus的COI DNA序列相似度高于99%，说明DNA条形码技术可作为燕窝基源判断技术之一。王凤云等[19]对不同品种及产地燕窝提取其DNA，利用ND2序列进行扩增测序，构建了NJ系统发育树，结果表明，市场上官燕的均为爪哇金丝燕（Aerodramus fuciphagus）或其亚种A. fuciphagus germani，为后续生物鉴别研究奠定了基础。
1 PCR技术在燕窝中应用
PCR技术模拟DNA天然复制过程，在体外DNA的特异序列进行扩增，从而获得大量的同一序列。与扩增特异性密切相关的因素是与待扩增的特异序列两端互补的2个寡核苷酸引物（上游引物和下游引物）。该技术是基因扩增技术的一次重大改革，是分子生物学发展史中的一个重要里程碑，经过一系列研究产生了限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术、原位PCR技术、多重PCR技术、巢式PCR（NEST PCR）技术、反向PCR（Inverse PCR，IPCR）技术、锚定PCR（Anchored PCR，APCR）技术、反转录PCR（reverse transcription，RT-PCR）技术、修饰引物PCR技术、等位基因特异性PCR（Allele-specific PCR，ASPCR）技术、单链构型多肽性PCR（single-strandconformational polymorphism PCR，SSCPPCR）技术、竞争性PCR（competitive PCR，c-PCR）技术、差示PCR（differential PCR，d-PCR）技术等技术在检测方面的运用。RT-PCR技术的产生使PCR技术产生了质飞跃，其最主要特点是定量范围宽、灵敏度高，并能同时处理多个样本。 Liu等[20]收集了来自42个不同地区的燕窝样本，通过测序分析和系统发育分类，初步确定其来源，在对该物种的限制图谱分析中发现2个稳定的酶消化位点，最后建立了快速及特异性强的限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）方法来鉴定燕窝样品的来源。陈筱婷[21]建立了多重RT-PCR对燕窝中主要成分及其掺假成分进行检测，可以特异性地检测燕窝中金丝燕、银耳、红藻和石花菜成分，其特异性强、灵敏度高，可作为燕窝及其制品掺假的定性鉴别。刘敬等[22]采集了25份未经加工的东南亚燕窝的12S rRNA和Cytb基因序列通过分析，利用直接提取的燕窝DNA模板，然后重新设计了12S rRNA和Cytb基因序列，并进行相关克隆测序，结果表明扩增的均正确来自其对应的线粒体基因序列。Meei等[23]基于线粒体和核DNA序列的核苷酸测序（FINS）技术，建立了一种快速且经济有效的SYBR green I的实时荧光定量检测方法，可用于燕窝真伪鉴别。陈月娟等[24]从马来西亚、印度尼西亚、越南和泰国收集了39个燕窝样本，提取了用于PCR反应的基因组DNA并对扩增产物进行了测序，结果表明39种样品来自3种燕窝。通过NJ和UPMGA系统发育树可以成功地区分样品，这意味着cytb序列可用于区分燕窝的起源，并且可以有效地追踪燕窝的起源物种。Lv等[25]基于遗传信息和变态扩增系统（ARMS-PCR）建立了一种快速、简单、准确的燕窝基因鉴定方法。Quek等[26]基于线粒体和核DNA序列的遗传信息核苷酸测序技术，并进行了系统发育分析来确定燕窝类型和来源，结果表明，Cytb、ND2、12S核糖体RNA和β-纤维蛋白原内含子7基因标记可以有效地区分A. fuciphagus和A. maximus。此外，通过对线粒体cytb和ND2基因进行测序，可以有效地区分屋燕和洞燕。
2 DNA指纹技术
DNA指纹技术（DNA fingerprint technique）是分子生物学中一种新技术，在生物组织中提取DNA片段后进行PCR扩增出完整的基因组的DNA，然后酶切成DNA片段，进行SDS电泳根据分子量大小进行分离。DNA指纹技术包括：限制性酶切片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性（RAPD）、微卫星技术又称简单重复序列（SSR）、核糖体脱氧核糖核酸（rDNA）序列分析、扩增片段长度多态性（AFLP）和单核苷酸多态性（SNP）等。
DNA指纹技术的主要特点如下：（1）简单的遗传方式，遵循简单的孟德尔遗传方式;（2）高度变异性，不同的个体或群体有不同的DNA指纹图且存在差异;（3）多位点性，可以同时检测基因组中数十个位点的变异性;（4）不受外界因素的干扰;（5）不受种类组织差异、不同生长阶段等的影响;（6）有许多标记表现为共显性，能鉴别纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息;（7）信息量大，高分辨率;（8）技术段简单、快速、自动化程度高;（9）提取的样本在适合环境下能够长期存储，有利于数据溯源追踪或仲裁性鉴定等。因此，DNA指纹技术可用于中草药鉴别、真菌分类上应用、畜禽亲缘系统分类应用、法医学鉴定应用、样品的真伪鉴别、掺假鉴定及珍贵产品的溯源等。
John等[27]利用信息丰富的SNP标记对越南的1570个木薯克隆进行了分子分析，揭示了农民田间和种质库中的品种组成，可用于异地品质木薯的筛选。Schüller等[28]利用2个多重PCR反应中优化的11个SSR标记对63份樱桃进行基因分型，鉴定出38个不同等位型，平均每个位点检测到6.3个等位基因，PIC值为0.59。此外，利用8个选择性引物组合衍生的223个AFLP标记进一步区分17份亲缘关系较近的樱桃，结果表明：SSR指纹图谱可用于樱桃的种类鉴定;崔学强等[29]利用ISSR分子标记技术对22中石斛兰进行了亲缘关系及遗传多样性的检测分析，结果表明22种石斛兰表现出丰富的遗传多样性，构建的DNA指纹图谱可鉴别出22种石斛兰，可为石斛兰品质资源鉴定、杂交育种亲本选择等提供可靠的依据及帮助。李涛等[30]通过建立核磁共振氢谱（1H-NMR）指纹图谱技术结合多元统计分析方法对不同产地的大花红景进行有效分类和不同产地的鉴别。付涛等[31]利用EST-SSR对铁皮石斛近原物种进行了EST序列开发，结果表明，43对引物可以擴增出清晰谱带、多态性较好的条带，为有效鉴别铁皮石斛品种、种质资源、遗传谱图的建立等提供理论依据。Sunar等[32]采用ISSR和RAPD分析技术对15个丹参种间的亲缘关系进行了研究，发现物种间的相似性介于0.54～0.93，表明这2个标记是评价丹参物种间遗传多样性和亲缘关系的可靠手段，为后续丹参种间的亲缘关系鉴定奠定了基础。史中飞等[33]利用PCR-RFLP对当归中掺入的欧当归进行进行研究，结果表明，PCR-RFLP鉴别方法能够快速、准确、灵敏应用于当归药材及其饮片中是否掺入欧当归，为当归的品质提供了可靠的检测手段，进一步为其临床应用保驾护航。
虽然DNA指纹技术已在食品生物源性方面被广泛研究与应用，但是目前将该技术应用于燕窝及其制品的鉴定溯源等研究，国内外相关报道较为罕见。其主要原因可能是燕窝及其制品成为产品前需要经过多道工序的加工处理，在加工过程中燕窝部分DNA出现了较多降解，不易提取纯化，富集的DNA片段可能多为小分子片段，所以建立燕窝特异性DNA指纹图片难度较大。但是，可对燕窝的掺假鉴定及其产地溯源进行多方面研究，可快速准确的鉴别掺假燕窝，给企业选择优良的燕窝产地及燕窝原料提供方向，以期为提高市场上燕窝的品质提供有效的支撑。
3 基因芯片技术
基因芯片技术（gene chip technology，GCT），又称DNA微阵列、寡核苷酸微芯片或寡核苷酸阵列，是生物芯片中极为重要的一种，也是其发展的重点技术之一。基因芯片诞生于20世纪的一项新技术，与过去的研究方法对比，基因芯片特点主要显现在其高度并行性、高度自动化、多样性和微型化，是一种获得大量微生物信息的可靠技术[341-35]。基因芯片原理是通过基因探针结合核酸杂交技术，以经过特殊处理的硅片、玻片、硝酸纤维膜等为载体，将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于其上，根据碱基互补配对原则与荧光标记法或同位素标记过的样品进行多元杂交，利用杂交信号的强弱及分布，来分对照析目的分子的有无、数量及序列，以次测出受检样品的遗传信息，最终由计算机软件进行自动化分析、解读完成结果的定性或定量试验。基因芯片的主要类型有无机片基和有机合成物的基因芯片、原位合成和预先合成然后点样的基因芯片。 [29]崔学强，唐璇，黄昌艳，等.22种石斛兰遗传多样性分析及DNA指纹图谱构建[J].分子植物育种，2021（09）：3005-3014.
[30]李涛，司梦鑫，李冲.1H-NMR指纹图谱技术结合多元统计分析鉴别不同产地的大花红景天[J].中药材，2018，041（010）：2290-2295.
[31]付涛，胡仲义，何月秋，等.铁皮石斛EST-SSR分子标记的开发[J].核农学報，2017（4）：663-670.
[32]Sunar S，Korkmaz M，Simaz B，et al. Determination of the Genetic Relationships Among Salvia Species by RAPD and ISSR Analyses[J].Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences，2020，17（5）：480-485.
[33]史中飞，滕宝霞，赖晶，等.PCR-RFLP鉴别当归药材及饮片中掺混伪品——欧当归的方法[J].中国实验方剂学杂志，2021，27（9）：168-175.
[34]Jung HY，Han HS，Kim HB，et al. Comparison of analytical and clinical performance of HPV 9G DNA Chip，PANArray HPV genotyping chip，and hybrid-capture II assay in cervicovaginal Swabs[J].J Pathol Transl Med，2016，50：138-146.
[35]Li Q，Wu C，Song G，et al. Genome-Wide analysis of long noncoding RNA expression profiles in human xuanwei lung cancer[J].Clin Lab，2015，61（10）：1515-1523.
[36]J，Abdullah，N，et al. Rapid detection of Salmonella Typhi by loop-mediated isothermal amplification （LAMP） method.[J].Brazilian journal of microbiology ： publication of the Brazilian Society for Microbiology，2014，45（4）：1385-1391.
[37]祝儒刚，李拖平，宋立峰.应用基因芯片技术检测肉及肉制品中5种致病菌[J].食品科学，2012，033（014）：211-215.