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摘 要：从海南省三亚市崖州区养殖的罗非鱼中分离得到一株优势病原菌，命名为HH-0708.经由16S rDNA序列测定、菌落形态观察、生理生化试验，HH-0708被鉴定为无乳链球菌。HH-0708体外药敏结果显示：其对青霉素、头孢呋辛、多西环素等11种抗生素高度敏感，而对四环素、庆大霉素等9种抗生素表现出较强的耐药性，对链霉素、红霉素等其他5种抗生素，表现为中度敏感。
关键词：罗非鱼;无乳链球菌;16S rDNA;药敏试验;生化实验
中图分类号： S943
自1976年起，于水生生物海豚中首次分离到链球菌后，链球菌类的细菌性疾病便在罗非鱼、宝石鲈等水生生物养殖中多次爆发，造成严重的经济损失[1-3]。因罗非鱼具有良好的繁殖能力，肉质鲜美，无肌间刺，具有较高的经济价值，所以成为我国重要的水产养殖品种[4-5]。但是由于养殖密度的增高，抗生素滥用等问题，链球菌等细菌性疾病频发，造成了严重的经济损失。为更好进行疾病防控，需从病鱼中分离病原菌，了解其生理生化特性后，再深入进行病原菌耐药性[6-8]、毒力因子[9]、疫苗方面[10]的研究，方便对同类疾病进行快速、精确防控。
海南省三亚市网箱养殖罗非鱼爆发细菌性疾病，从中分离得到一株病原菌，通过序列比对和生理生化分子鉴定，确定为罗非鱼源的无乳链球菌，在实验室内利用纸片扩散法，对药物敏感性进行检测，为避免罗非鱼源细菌性病害的大规模爆发，以及养殖的进一步发展提供生物学基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
2020年7月份，海南省三亚市崖州区牛落水库网箱中罗非鱼出现大量死亡的情况，发病罗非鱼的体长为12～15 cm，体质量为100～200 g。观察并记录鱼体的运动状况及病理特征，从罗非鱼养殖网箱内捞出10尾濒死的罗非鱼，塑料袋充氧后运回实验室，进行后续病原分离、病原鉴定实验。实验所用材料见表1。
1.2 病原菌的分离、纯化
在超净工作台内，用75%乙醇擦拭濒死的罗非鱼体表，之后进行罗非鱼各组织、器官的病原分离，具体包括：肝脏、脑、脾脏、血液、肾脏等，组织样在脑心津液固体培养基上划线，培养环境：30 ℃恒温培养箱;培养时间：24 h。对平板上的优势菌落进行三区划线，纯化菌株。对纯化后长出的单一菌落进行保种，具体操作：制备好无菌脑心津液培养基，将单菌落转接于培养基内，培养环境：30 ℃振荡培养箱;转速设定：180 r/min;培养时间：16～20 h，后将培养好的菌液与50%的无菌甘油混合，于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。
1.3 病原菌鉴定
1.3.1 病原菌形态观察 将病原菌划线、纯化的脑心津液培养皿倒置，培养环境：30 ℃恒温培养箱;培养时间：20 h，观察并记录菌落形态。
1.3.2 分子鉴定
1.3.2.1 PCR扩增与测序 提取菌液DNA后，利用细菌16S的通用引物进行扩增，序列预期长度为 1 500 bp。取6 μL的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，部分扩增产物寄送基因技术有限公司，获取菌株16S核酸序列。
16S通用引物序列为：
27 F ：（ 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3’）
1 492 R ：（ 5’- GGTTACCTTGTTACGACTT - 3’）
1.3.2.2 系统发育进化树的构建 登入NCBI官网，将测序结果上传至Microbes，进行Blastn同源性分析，记录查询结果，并下载链球菌属核酸序列。利用Mega7.0软件，生成HH-0708的系统发育进化树，设定构建法则：邻接法;Bootstrap值：1 000;距离检测方法：clustal V。
1.3.3 生理生化鉴定 利用生化鉴定管的反应情况，根据不同功能产生的生理生化反应對菌株种属进行鉴定，观察其与各种酶类发生氧化发酵的能力，水解七叶苷和明胶的能力，利用各种糖类产酸的能力，以及不同盐度下的生长能力的变化。对照菌株：无乳链球菌（NCTC8181）。
1.4 药敏试验
本次药敏试验原理为纸片扩散法。具体操作：将上述培养好的菌液，吸取100 μL，均匀涂布于LB平板，后取药敏纸片贴于该涂布平板表面。药敏平板培养温度：30 ℃;倒置培养;培养时间：24 h。利用游标卡尺测定抑菌圈直径，并判断菌株对各抗生素的敏感性。
2 结果
2.1 病原菌的形态学观察
对脑、肝脏、脾脏等取样部位进行病原菌的分离，长出的菌落形态基本一致，认定为优势病原菌落。挑取长出的单菌落，于无菌的脑心津液培养基进行划线纯化，长出的菌落形态一致，均表面光滑、边缘整齐，呈乳白色。2.2 病原菌的分类鉴定
2.2.1 病原菌系统进化分析 利用细菌16S通用引物即27 F和1492 R构建PCR体系，通过2720型PCR仪对HH-0708菌株DNA进行 PCR扩增处理，通过琼脂糖凝胶结果显示条带长度为1.5 kbp，将测序结果上传至NCBI网站上进行Blastn同源性分析，菌株 HH-0708与结果中各类无乳链球菌相似性均达99.67%。下载16S 核酸序列，运用MEGA 7.0软件的邻接法构建系统发育树（图1）。由图1可见，该病原菌株HH-0708与菌株NCTC8187聚为一支。
2.2.2 生理生化特性 为描述HH-0708的生理生化特性，利用生化鉴定管分析该病原菌利用各类物质的能力（如表2），结果显示，菌株 HH-0708和标准菌株NCTC8181均在MR反应、鸟氨酸脱羧酶反应、丙氨酸生化反应中表现出阳性;HH-0708可以利用麦芽糖、甘露糖、蔗糖、蕈糖、果糖、半乳糖、甘露糖、水杨素发生阳性反应，分解糖类产酸供能。无法水解七叶苷和明胶进行水解反应;在各梯度盐度下无法完成正常的生长;无法利用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇、纤维二糖、木糖、乳糖等低聚糖和甘油、肌醇进行产酸反应。HH-0708与NCTC8181在利用各类糖类的能力上略有不同。 2.3 藥敏试验
对致病菌HH-0708进行药敏试验，在25种药敏纸片呈现出不同的敏感表现（如表3）。该病原菌对多西环素、头孢他啶、呋喃妥因、左氧氟沙星、大观霉素、阿莫西林、头孢呋辛、氟苯尼考、环丙沙星、复方新诺明、青霉素共11种抗生素敏感，即对测定的头孢类和部分喹诺酮类抗生素表现为高度敏感;对多黏菌素B、红霉素、诺氟沙星、依诺沙星、链霉素5种抗生素呈现中度敏感，对喹诺酮类部分抗生素表现为药物中度敏感;而对呋喃唑酮、氨苄西林、新霉素、四环素、庆大霉素等9种抗生素表现出耐药性，主要对β-内酰胺类抗生素显示强耐药性。
3 讨论
3.1 病原分离与鉴定
2020年7月针对海南养殖网箱患病罗非鱼进行研究，从发病罗非鱼的脑、肝脏、脾脏等部位分离病原菌，发现长出的菌落颜色、形态一致，所以从中挑取一株菌进行后续病原鉴定实验。通过菌落形态记录，利用BLAST比对其16S rDNA序列，发现与NCTC8187标准菌株表现出高度的同源性，并完成系统发育进化树。
3.2 药敏试验及防治措施
将本次药敏结果与不同地区下分离得到的无乳链球菌药物分析结果进行比较[11-14]，除青霉素外，HH-0708对环丙沙星、复方新诺明、氟苯尼考等药物表现出高度敏感性，但对红霉素表现为中度敏感，造成这种差异的原因：一是不同地区菌株遗传背景具有差异性，导致部分药物敏感性不一致[15-16];二是长期使用、滥用单一抗生素，使细菌的毒力因子、耐药因子的表达发生变化，病原菌本身耐药和获得性耐药能力不断提升，造成红霉素等抗生素药物敏感性下降，抗生素防治疾病效果下降[17-20];除此之外，还有其他环境条件等其他因素，导致致病菌株的药物敏感性不断变化，出现抗生素“失效”或“低效”的现象。
目前，禁用的渔用抗生素种类不断增加[21]，一方面有效避免了抗生素的滥用，而另一方面抗生素的使用受限增加了防控细菌性疾病的难度，所以应当积极寻找快速、有效的抗生素替代途径来治疗水生生物的细菌性疾病，如研制疫苗[22]，开发抗菌肽[23]，进行中草药防治[24-25]等，控制无乳链球菌在罗非鱼中的进一步传播。
4 结论
通过对病原菌的形态特征、生化特性、序列分析等结果分析，将该菌株鉴定为无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）。目前，抗生素仍是一种主要的疾病防控手段。为了防止抗生素的滥用，可以利用纸片扩散法有效筛选目标抗生素，迅速、谨慎确定给药方案，从而高效防控链球菌疾病的发展。
参考文献：
[1] PIER G B， MADIN S H.Streptococcus iniae sp. nov.， a Beta-Hemolytic Streptococcus Isolated from an Amazon Freshwater Dolphin， Inia geoffrensis[J].International Journal of Systematic Bacteriology， 1976，26（4）：545-553.
[2] LIU L，LI Y W，HE R Z，et al.Outbreak of Streptococcus agalactiae infection in barcoo grunter， Scortum barcoo （McCulloch & Waite）， in an intensive fish farm in China[J].Journal of Fish Diseases，2014，37（12）：1067-1072.
[3] SAAD M Z，AZMAL M N A，ABDULLAH S Z，et al.Control and prevention of Streptococcosis in cultured tilapia in Malaysia：a review[J].Pertanika Journal of Tropical Agricultural Science，2014，37（4）：389-410.
[4] KAYANSAMRUAJ P，PIRARAT N，KATAGIRI T，et al.Molecular characterization and virulence gene profiling of pathogenic Streptococcus agalactiae populations from tilapia （Oreochromis sp.） farms in Thailand[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2014，26（4）：488-495.
[5] 肖俊，甘西，罗永巨.罗非鱼育种研究进展[J].湖南科技大学学报（自然科学版），2014（1）：106-112.
[6] 尹欣悦，吴鹏，马忠臣，等.一株无乳链球菌的分离鉴定与耐药性分析[J].黑龙江畜牧兽医，2020（22）：99-101+168.
[7]林华剑.无乳链球菌对抗菌类药物的感受性研究[J].海洋与渔业，2019（7）：100-101.
[8] 范雪，邵伟，赵艳坤，等.无乳链球菌毒力基因与耐药性的相关性研究进展[J].中国畜牧兽医，2021，48（1）：375-384.
[9] 刘礼辉，张德锋，李宁求，等.鲮鱼源无乳链球菌的鉴定， 血清型分析及药敏试验[J].南方农业学报，2015，46（11）：2053-2058.
[10] RAMOS-ESPINOZA F C，CUEVA-QUIROZ V A，YUNIS-AGUINAGA J，et al.A comparison of novel inactivation methods for production of a vaccine against Streptococcus agalactiae in Nile tilapia Oreochromis niloticus[J].Aquaculture， 2020，528：735484，
关键词：罗非鱼;无乳链球菌;16S rDNA;药敏试验;生化实验
中图分类号： S943
自1976年起，于水生生物海豚中首次分离到链球菌后，链球菌类的细菌性疾病便在罗非鱼、宝石鲈等水生生物养殖中多次爆发，造成严重的经济损失[1-3]。因罗非鱼具有良好的繁殖能力，肉质鲜美，无肌间刺，具有较高的经济价值，所以成为我国重要的水产养殖品种[4-5]。但是由于养殖密度的增高，抗生素滥用等问题，链球菌等细菌性疾病频发，造成了严重的经济损失。为更好进行疾病防控，需从病鱼中分离病原菌，了解其生理生化特性后，再深入进行病原菌耐药性[6-8]、毒力因子[9]、疫苗方面[10]的研究，方便对同类疾病进行快速、精确防控。
海南省三亚市网箱养殖罗非鱼爆发细菌性疾病，从中分离得到一株病原菌，通过序列比对和生理生化分子鉴定，确定为罗非鱼源的无乳链球菌，在实验室内利用纸片扩散法，对药物敏感性进行检测，为避免罗非鱼源细菌性病害的大规模爆发，以及养殖的进一步发展提供生物学基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
2020年7月份，海南省三亚市崖州区牛落水库网箱中罗非鱼出现大量死亡的情况，发病罗非鱼的体长为12～15 cm，体质量为100～200 g。观察并记录鱼体的运动状况及病理特征，从罗非鱼养殖网箱内捞出10尾濒死的罗非鱼，塑料袋充氧后运回实验室，进行后续病原分离、病原鉴定实验。实验所用材料见表1。
1.2 病原菌的分离、纯化
在超净工作台内，用75%乙醇擦拭濒死的罗非鱼体表，之后进行罗非鱼各组织、器官的病原分离，具体包括：肝脏、脑、脾脏、血液、肾脏等，组织样在脑心津液固体培养基上划线，培养环境：30 ℃恒温培养箱;培养时间：24 h。对平板上的优势菌落进行三区划线，纯化菌株。对纯化后长出的单一菌落进行保种，具体操作：制备好无菌脑心津液培养基，将单菌落转接于培养基内，培养环境：30 ℃振荡培养箱;转速设定：180 r/min;培养时间：16～20 h，后将培养好的菌液与50%的无菌甘油混合，于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。
1.3 病原菌鉴定
1.3.1 病原菌形态观察 将病原菌划线、纯化的脑心津液培养皿倒置，培养环境：30 ℃恒温培养箱;培养时间：20 h，观察并记录菌落形态。
1.3.2 分子鉴定
1.3.2.1 PCR扩增与测序 提取菌液DNA后，利用细菌16S的通用引物进行扩增，序列预期长度为 1 500 bp。取6 μL的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，部分扩增产物寄送基因技术有限公司，获取菌株16S核酸序列。
16S通用引物序列为：
27 F ：（ 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3’）
1 492 R ：（ 5’- GGTTACCTTGTTACGACTT - 3’）
1.3.2.2 系统发育进化树的构建 登入NCBI官网，将测序结果上传至Microbes，进行Blastn同源性分析，记录查询结果，并下载链球菌属核酸序列。利用Mega7.0软件，生成HH-0708的系统发育进化树，设定构建法则：邻接法;Bootstrap值：1 000;距离检测方法：clustal V。
1.3.3 生理生化鉴定 利用生化鉴定管的反应情况，根据不同功能产生的生理生化反应對菌株种属进行鉴定，观察其与各种酶类发生氧化发酵的能力，水解七叶苷和明胶的能力，利用各种糖类产酸的能力，以及不同盐度下的生长能力的变化。对照菌株：无乳链球菌（NCTC8181）。
1.4 药敏试验
本次药敏试验原理为纸片扩散法。具体操作：将上述培养好的菌液，吸取100 μL，均匀涂布于LB平板，后取药敏纸片贴于该涂布平板表面。药敏平板培养温度：30 ℃;倒置培养;培养时间：24 h。利用游标卡尺测定抑菌圈直径，并判断菌株对各抗生素的敏感性。
2 结果
2.1 病原菌的形态学观察
对脑、肝脏、脾脏等取样部位进行病原菌的分离，长出的菌落形态基本一致，认定为优势病原菌落。挑取长出的单菌落，于无菌的脑心津液培养基进行划线纯化，长出的菌落形态一致，均表面光滑、边缘整齐，呈乳白色。2.2 病原菌的分类鉴定
2.2.1 病原菌系统进化分析 利用细菌16S通用引物即27 F和1492 R构建PCR体系，通过2720型PCR仪对HH-0708菌株DNA进行 PCR扩增处理，通过琼脂糖凝胶结果显示条带长度为1.5 kbp，将测序结果上传至NCBI网站上进行Blastn同源性分析，菌株 HH-0708与结果中各类无乳链球菌相似性均达99.67%。下载16S 核酸序列，运用MEGA 7.0软件的邻接法构建系统发育树（图1）。由图1可见，该病原菌株HH-0708与菌株NCTC8187聚为一支。
2.2.2 生理生化特性 为描述HH-0708的生理生化特性，利用生化鉴定管分析该病原菌利用各类物质的能力（如表2），结果显示，菌株 HH-0708和标准菌株NCTC8181均在MR反应、鸟氨酸脱羧酶反应、丙氨酸生化反应中表现出阳性;HH-0708可以利用麦芽糖、甘露糖、蔗糖、蕈糖、果糖、半乳糖、甘露糖、水杨素发生阳性反应，分解糖类产酸供能。无法水解七叶苷和明胶进行水解反应;在各梯度盐度下无法完成正常的生长;无法利用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇、纤维二糖、木糖、乳糖等低聚糖和甘油、肌醇进行产酸反应。HH-0708与NCTC8181在利用各类糖类的能力上略有不同。 2.3 藥敏试验
对致病菌HH-0708进行药敏试验，在25种药敏纸片呈现出不同的敏感表现（如表3）。该病原菌对多西环素、头孢他啶、呋喃妥因、左氧氟沙星、大观霉素、阿莫西林、头孢呋辛、氟苯尼考、环丙沙星、复方新诺明、青霉素共11种抗生素敏感，即对测定的头孢类和部分喹诺酮类抗生素表现为高度敏感;对多黏菌素B、红霉素、诺氟沙星、依诺沙星、链霉素5种抗生素呈现中度敏感，对喹诺酮类部分抗生素表现为药物中度敏感;而对呋喃唑酮、氨苄西林、新霉素、四环素、庆大霉素等9种抗生素表现出耐药性，主要对β-内酰胺类抗生素显示强耐药性。
3 讨论
3.1 病原分离与鉴定
2020年7月针对海南养殖网箱患病罗非鱼进行研究，从发病罗非鱼的脑、肝脏、脾脏等部位分离病原菌，发现长出的菌落颜色、形态一致，所以从中挑取一株菌进行后续病原鉴定实验。通过菌落形态记录，利用BLAST比对其16S rDNA序列，发现与NCTC8187标准菌株表现出高度的同源性，并完成系统发育进化树。
3.2 药敏试验及防治措施
将本次药敏结果与不同地区下分离得到的无乳链球菌药物分析结果进行比较[11-14]，除青霉素外，HH-0708对环丙沙星、复方新诺明、氟苯尼考等药物表现出高度敏感性，但对红霉素表现为中度敏感，造成这种差异的原因：一是不同地区菌株遗传背景具有差异性，导致部分药物敏感性不一致[15-16];二是长期使用、滥用单一抗生素，使细菌的毒力因子、耐药因子的表达发生变化，病原菌本身耐药和获得性耐药能力不断提升，造成红霉素等抗生素药物敏感性下降，抗生素防治疾病效果下降[17-20];除此之外，还有其他环境条件等其他因素，导致致病菌株的药物敏感性不断变化，出现抗生素“失效”或“低效”的现象。
目前，禁用的渔用抗生素种类不断增加[21]，一方面有效避免了抗生素的滥用，而另一方面抗生素的使用受限增加了防控细菌性疾病的难度，所以应当积极寻找快速、有效的抗生素替代途径来治疗水生生物的细菌性疾病，如研制疫苗[22]，开发抗菌肽[23]，进行中草药防治[24-25]等，控制无乳链球菌在罗非鱼中的进一步传播。
4 结论
通过对病原菌的形态特征、生化特性、序列分析等结果分析，将该菌株鉴定为无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）。目前，抗生素仍是一种主要的疾病防控手段。为了防止抗生素的滥用，可以利用纸片扩散法有效筛选目标抗生素，迅速、谨慎确定给药方案，从而高效防控链球菌疾病的发展。
参考文献：
[1] PIER G B， MADIN S H.Streptococcus iniae sp. nov.， a Beta-Hemolytic Streptococcus Isolated from an Amazon Freshwater Dolphin， Inia geoffrensis[J].International Journal of Systematic Bacteriology， 1976，26（4）：545-553.
[2] LIU L，LI Y W，HE R Z，et al.Outbreak of Streptococcus agalactiae infection in barcoo grunter， Scortum barcoo （McCulloch & Waite）， in an intensive fish farm in China[J].Journal of Fish Diseases，2014，37（12）：1067-1072.
[3] SAAD M Z，AZMAL M N A，ABDULLAH S Z，et al.Control and prevention of Streptococcosis in cultured tilapia in Malaysia：a review[J].Pertanika Journal of Tropical Agricultural Science，2014，37（4）：389-410.
[4] KAYANSAMRUAJ P，PIRARAT N，KATAGIRI T，et al.Molecular characterization and virulence gene profiling of pathogenic Streptococcus agalactiae populations from tilapia （Oreochromis sp.） farms in Thailand[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2014，26（4）：488-495.
[5] 肖俊，甘西，罗永巨.罗非鱼育种研究进展[J].湖南科技大学学报（自然科学版），2014（1）：106-112.
[6] 尹欣悦，吴鹏，马忠臣，等.一株无乳链球菌的分离鉴定与耐药性分析[J].黑龙江畜牧兽医，2020（22）：99-101+168.
[7]林华剑.无乳链球菌对抗菌类药物的感受性研究[J].海洋与渔业，2019（7）：100-101.
[8] 范雪，邵伟，赵艳坤，等.无乳链球菌毒力基因与耐药性的相关性研究进展[J].中国畜牧兽医，2021，48（1）：375-384.
[9] 刘礼辉，张德锋，李宁求，等.鲮鱼源无乳链球菌的鉴定， 血清型分析及药敏试验[J].南方农业学报，2015，46（11）：2053-2058.
[10] RAMOS-ESPINOZA F C，CUEVA-QUIROZ V A，YUNIS-AGUINAGA J，et al.A comparison of novel inactivation methods for production of a vaccine against Streptococcus agalactiae in Nile tilapia Oreochromis niloticus[J].Aquaculture， 2020，528：735484，