论文部分内容阅读
第一部分LncRNA H19在心肌缺血再灌注损伤与七氟醚后处理中的表达水平目的:探讨七氟醚后处理对心肌缺血再灌注损伤的影响,以及观察lncRNAH19在心肌缺血再灌注损伤和七氟醚后处理中的表达水平。方法:1.大鼠离体心脏实验:清洁级雄性SD大鼠48只,体重200～250g,采用随机数字表法分为4组(n=12):对照组(C组)、心肌缺血再灌注组(I/R组)、缺血后处理组(IPC组)和七氟醚后处理组(SPC组)。缺血30min再灌注120min制备Langendorff离体心脏缺血再灌注模型。C组持续灌注K-H液150min;I/R组缺血30min后,K-H液再灌注120min;IPC组缺血30min后,行4个循环复灌20s/缺血20s,再灌注K-H液;SPC组缺血30min后,再灌注饱含2.5%七氟醚的K-H液15min,再灌注K-H液;IPC组和SPC组再灌注总时间120min。于平衡灌注末(基础状态)(T0)与再灌注30min、60min、90min和120min(T1～4)时测心功能指标和心肌灌流液中LDH和CPK活性。再灌注结束时取心脏测心肌梗死面积,计算细胞凋亡指数(AI),采用荧光实时定量PCR法测心肌组织中H19表达水平。2.细胞实验:H9c2心肌细胞,采用随机数字表法分为4组:对照组(C组)、缺氧复氧组(A/R组)、缺氧后处理组(APC组)和七氟醚后处理组(SPC组)。采用缺氧液和缺氧复氧装置,缺氧3h和复氧3h构建H9c2心肌细胞A/R损伤模型。APC组缺氧3h后,行3个循环复氧5min/缺氧5min,再复氧;SPC组缺氧3h后用2.5%七氟醚预充的DMEM无血清培养基处理30min,再复氧;APC组和SPC组复氧总时间3h。实验结束后,取心肌细胞培养液检测LDH和CPK活性,采用MTT法检测心肌细胞存活率,采用流式细胞检测细胞凋亡率,采用荧光实时定量PCR法测心肌细胞H19表达水平。结果:1.离体实验结果:与To时比较,除C组外,其它各组T1～4时HR、LVSP、±dp/dtmax明显降低,LVEDP升高(P<0.05);与C组比较,I/R组各时间点HR、LVSP、±dp/dtmax降低,LVEDP升高,心肌细胞灌流液LDH和CPK活性升高,心肌梗死面积增加,AI升高(P<0.05);心肌组织H19相对表达量有上升趋势,但无统计学意义(P>0.05);与I/R组比较,IPC组和SPC组各时间点LVSP和±dp/dtmax升高,LVEDP降低,心肌细胞灌流液LDH和CPK活性降低,心肌梗死面积减小,AI降低,心肌组织H19相对表达量上调(P<0.05)。2.细胞实验结果:与C组比较,A/R组心肌细胞培养液中LDH和CPK活性、细胞凋亡率升高,细胞存活率降低(P<0.05);心肌细胞H19相对表达量有上升趋势,但无统计学意义(P>0.05);与A/R组比较,APC组和SPC组心肌细胞存活率升高,心肌细胞培养液LDH和CPK活性降低,细胞凋亡率降低,心肌细胞H19相对表达量上调(P<0.05)。结论:1.在大鼠离体心脏和H9c2心肌细胞水平结果均表明七氟醚后处理可通过改善心功能指标,减少心肌梗死的面积,降低LDH和CPK活性,降低AI和心肌细胞凋亡率,提高心肌细胞存活率而发挥着减轻心肌缺血再灌注损伤的作用。2.七氟醚后处理可显著上调H19表达,提示H19可能参与了七氟醚后处理的心肌保护作用。第二部分下调IncRNAH19表达对七氟醚后处理心肌保护的影响目的:探讨下调lncRNAH19表达对七氟醚后处理心肌保护的影响。方法:1.采用RNA干扰技术特异性沉默H19,构建pGreenpuro-shlncRNA H19重组质粒,然后转染到H9c2心肌细胞,进行干扰效率的检测。2.将H9c2心肌细胞随机分为5组:C组、A/R组、七氟醚后处理组(Sevo组)、七氟醚后处理+H19干扰表达组(Sevo+shH19组)和七氟醚后处理+H19干扰空载组(Sevo+H19-shNC组)。采用H9c2心肌细胞缺氧3h、复氧3h构建心肌细胞A/R模型;Sevo组缺氧3h后用2.5%七氟醚预充的DMEM无血清培养基处理30min,复氧总时间3h;Sevo+shH19组和Sevo+H19-shNC组缺氧复氧前48h用干扰载体shH19和干扰空载pGreenpuro质粒转染H9c2细胞,余步骤同Sevo组。实验结束后,检测心肌细胞培养液LDH和CPK活性,检测心肌细胞MDA、SOD和caspase-3的水平,采用MTT法检测心肌细胞存活率,流式细胞检测心肌细胞线粒体膜电位和细胞凋亡率,分离心肌细胞线粒体和胞浆,采用Western blot法测定Cyt c的表达。结果:1.验证结果显示shH19-3干扰H19表达效果最显著,选为干扰载体;pGreenpuro本身作为干扰空载载体。2.与C组比较,A/R组心肌细胞培养液LDH和CPK活性升高,心肌细胞MDA含量升高,SOD活性降低,caspase-3活性和细胞凋亡率升高,心肌细胞存活率和线粒体膜电位降低,线粒体Cyt c表达下调,胞浆Cyt c表达上调(P<0.05);与A/R组比较,Sevo组心肌细胞培养液LDH和CPK活性降低,心肌细胞MDA含量降低,SOD活性升高,caspase-3活性和细胞凋亡率降低,细胞存活率和线粒体膜电位升高,线粒体Cyt c表达上调,胞浆Cyt c表达下调(P<0.05);与Sevo组比较,沉默H19表达后,心肌细胞培养液LDH和CPK活性升高,心肌细胞MDA含量升高,SOD活性降低,caspase-3活性和细胞凋亡率升高,心肌细胞存活率和线粒体膜电位降低,线粒体Cyt c表达下调,胞浆Cyt c表达上调(P<0.05)。结论:1.pGreenpuro-shlncRNAH19-3可有效下调H9c2心肌细胞H19表达。2.七氟醚后处理可减轻心肌细胞氧化应激水平,稳定线粒膜电位,抑制线粒体凋亡通路,而发挥心肌保护作用。但特异性沉默H19表达后消除了七氟醚后处理心肌保护的作用,说明七氟醚后处理心肌保护作用可能是由H19介导。第三部分PI3K/AKT信号通路在H19介导的七氟醚后处理心肌保护作用中的意义目的:探讨H19与PI3K/AKT信号通路的关系,以阐明七氟醚后处理的心肌保护作用机制。方法:1.构建H19表达载体:NCBI查找H19基因序列,引入酶切位点(BamHI/XbaI)合成基因片段,然后将目的基因片段与plvxpuro质粒进行重组,采用双酶切法验证,得到H19表达载体。再转染到H9c2心肌细胞进行验证,采用RT-PCR法测定H19表达水平验证高表效率。2.将H9c2心肌细胞随机分为7组:C组、A/R组、Sevo组、H19表达载体组(H19组)、H19表达空载组(H19-NC组)、七氟醚后处理+LY294002组(Sevo+LY294002组)和H19表达载体+LY294002组(H19+LY294002组)。H19组、H19+LY294002组和H19-NC组缺氧复氧前48h用表达载体H19和表达空载plvxpuro质粒转染H9c2细胞,采用H9c2心肌细胞缺氧3h和复氧3h构建心肌细胞A/R模型。Sevo组缺氧3h后,用2.5%七氟醚预充的DMEM无血清培养基处理30min,再复氧;Sevo+LY294002组缺氧3h后用经过2.5%七氟醚预充和含有LY294002(200μmol/L)的DMEM无血清培养基处理30min,再复氧;H19+LY294002组缺氧3h后用含有LY294002(200μmol/L)的DMEM无血清培养基处理30min,再复氧。复氧总时间3h。实验结束后,取心肌细胞培养液检测LDH和CPK活性,检测心肌细胞MDA、SOD和caspase-3的水平,采用MTT法检测心肌细胞存活率,流式细胞检测心肌细胞线粒体膜电位和细胞凋亡率,采用Western blot法分别测定PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT、线粒体Cyt c及胞浆Cytc的表达。结果:1.H9c2心肌细胞经plvxpuro-lncRNAH19重组质粒转染48h后,H19表达显著上调(P<0.05,vs Control),plvxpuro作为表达空载对H19表达没有影响。提示H19表达载体构建成功。2.与C组比较,A/R组心肌细胞培养液LDH和CPK活性升高,心肌细胞MDA含量升高,SOD活性降低,caspase-3活性和细胞凋亡率升高,心肌细胞存活率和线粒体膜电位降低,线粒体Cyt c表达下调,胞浆Cyt c表达上调(P<0.05);p-PI3K和p-AKT表达有上升的趋势,但无统计学意义(P>0.05);与A/R组比较,Sevo组和H19组心肌细胞培养液LDH和CPK活性降低,心肌细胞MDA含量降低,SOD活性升高,caspase-3活性和细胞凋亡率降低,心肌细胞存活率和线粒体膜电位升高,线粒体Cyt c表达上调,胞浆Cyt c表达下调,p-PI3K和p-AKT表达上调(P<0.05);给予PI3K特异性抑制剂LY294002后,心肌细胞培养液LDH和CPK活性升高,心肌细胞MDA含量升高,SOD活性降低,caspase-3活性和细胞凋亡率升高,心肌细胞存活率和线粒体膜电位降低,线粒体Cytc表达下调,胞浆Cyt c表达上调,p-PI3K和p-AKT表达下调。结论:1.表达载体plvxpuro-lncRNAH19可明显上调H9c2心肌细胞H19表达,H19表达载体构建成功。4.2 H19高表达可降低心肌细胞MDA含量,升高SOD活性,稳定线粒体膜电位和抑制线粒体细胞凋亡,说明H19高表达具有心肌保护的作用。4.3 H19高表达可上调心肌细胞磷酸化PI3K和AKT蛋白表达水平,而加入PI3K抑制剂LY294002,心肌细胞磷酸化PI3K和AKT蛋白表达水平明显下调,提示H19很有可能是通过PI3K/AKT信号转导通路来发挥着心肌保护作用。综上所述,七氟醚后处理通过上调lncRNAH19表达,激活PI3K/AKT信号通路,从而减轻氧化应激,稳定线粒体膜电位,抑制线粒体凋亡通路,最终减少细胞凋亡,对抗心肌I/R损伤。