论文部分内容阅读
背景:致病性钩端螺旋体(Leptospira,以下简称钩体)引起的钩体病(leptospirosis)是全球性流行的人畜共患传染病。出血和黄疸是钩体病典型的病理特征,但钩体病出血机制迄今不明。人血管性假血友病因子(von Willebtand factor,vWF)是重要的凝血因子,该因子与血小板膜糖蛋白-Ib的α亚基(GPIbα)结合后启动血小板聚集过程。致病性问号钩体(L.interrogans)基因种(genospecies)黄疽出血群赖型赖株vwa-Ⅰ与vwa-Ⅱ基因产物被注释为含vWF-A结构域的蛋白,但其在钩体病出血过程的作用及其机制未见研究报道。方法:采用pET42a表达载体和大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21DE3株表达宿主菌构建问号钩体赖株vwa-Ⅰ和vwa-Ⅱ基因原核表达系统。采用Ni-NTA亲和层析法提取vwa-Ⅰ和vwa-Ⅱ基因表达的重组蛋白rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ。采用鲎试验和Detoxi-gel脂多糖(LPS)亲和层析法分别检测和清除rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ中可能污染的大肠埃希菌LPS。采用流式细胞术、表面等离子共振(SPR)和等温滴定量热法(ITC)分别检测rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ与人血小板及其GPIbα的结合能力。采用共沉淀试验联合LC-MS/MS捕获并鉴定问号钩体赖株总蛋白中的人重组GPIbα(rHu-GPIbα)靶蛋白。采用生物发光血小板凝集测定仪检测rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ诱导人血小板聚集情况。采用Western Blot、分光光度和激光共聚焦显微镜法分别检测rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ作用人血小板后血小板聚集相关PI3K/AKT-ERK和PLC-PKC信号通路激酶磷酸化和活性介质水平。采用实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检问号钩体赖株感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后vwa-Ⅰ和vwa-Ⅱ基因表达水平变化及其产物外分泌情况。采用定位突变联合SPR或ITC检测rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ中与人重组GPIbα(rHu-GPIbα)的结合位点。采用HE染色镜检和血凝自动检测仪分别检测注射rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ的C3H/HeJ小鼠肺、肝、肾组织标本中出血情况以及外周血标本活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)。结果:问号钩体赖株vwa-Ⅰ和vwa-Ⅱ基因原核表达系统能有效表达目的重组蛋白 rLep-vWA-Ⅰ 和 rLep-vWA-Ⅱ。Detoxi-gel 亲和层析柱处理后 rLep-vWA-Ⅰ 和rLep-vWA-Ⅱ 中无 LPS。rLep-vWA-Ⅰ 和 rLep-vWA-Ⅱ 能与 81.7%～94.7%人血小板结合,但该结合可被rLep-vWA-Ⅰ-IgG和rLep-vWA-Ⅱ-IgG阻断。SPR和ITC结果显示,rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ能与rHu-GPIbα高亲和力结合,其KD为3.87×10-7-8.65×10-8 M。rHu-GPIbα可从问号钩体赖株总蛋白中捕获wva-Ⅰ和vwa-Ⅱ基因表达产物。rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ不能诱导人血小板聚集,但可阻断人重组vWF(Hu-rvWF)和协同因子瑞斯托霉素(ristocetin)诱导的血小板体外聚集。rLep-vWA-Ⅰ和rLep-vWA-Ⅱ作用后人血小板聚集相关信号通路激酶AKT、ERK、PLC和PKC磷酸化以及NO、cGMP、Ca2+、ADP和TXA2水平无显著改变。问号钩体赖株感染HUVEC后,vwa-Ⅰ和vwa-Ⅱ基因mRNA和蛋白表达水平显著升高并外分泌。Lep-vWA-Ⅰ 中 G13、G47、R36 和 Lep-vWA-Ⅱ 中 G76、Q126 突变后,与rHu-GPIbα结合能力以及抑制Hu-rvWF/ristocetin介导血小板聚集的作用显著下降甚至消失。静脉注射rLep-vWA-Ⅰ或rLep-vWA-Ⅱ后,小鼠肺和肾组织分别严重的弥漫性出血和局灶性出血,外周血APTT、PT和TT延长2.36～5.63倍。结论:问号钩体vwa-Ⅰ和vwa-Ⅱ基因产物能与vWF竞争性结合血小板GPIbα阻断vWF介导的人血小板聚集,从而导致钩体病人出血。