阿尔茨海默病(Alzheimer,s disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病,患者以日常生活中对人和事物的记忆、认知功能不可逆性下降为最明显表现,高龄是该病的主要发病诱因,所以又习惯称为老年性痴呆。现有研究指出,AD的病理改变是细胞外老年斑及细胞内神经纤维缠结的形成,β-淀粉样蛋白异常集聚形成老年斑,细胞内Tau蛋白过度病理性磷酸化是神经纤维缠结形成的基础。Aβ1-42对神经元小胶质细胞有显著的损伤作用,其可诱发神经炎症的发生和发展。Tau在人体内神经元中广泛存在,其单基因表达,唯一有效编码区位于17号常染色体。Tau蛋白做为微管相关蛋白之一,在细胞分裂、成熟的周期能有效聚合和稳定微管,对神经生长和运动起调控作用,故在神经细胞轴突中作用更加明显。病理性的Aβ可诱导蛋白磷酸激酶(如PKA、GSK3β)和蛋白磷酸酯酶(如PP-1、PP2A)错误折叠,而这种错误折叠后的诱导酶可引起Tau蛋白的过度磷酸化。在AD发生发展过程中,Aβ经过不断沉积,进而诱导细胞发生自噬和凋亡等病理改变,因Aβ的聚集是Tau蛋白病变的上游机制,而Tau蛋白的病变又以反馈机制促进Aβ聚集,所以Aβ的产生和Tau蛋白的磷酸化相辅相成,其二者与AD的发生发展密切相关。小鼠脑神经瘤细胞(Mouse neuroblastoma N2a cells,N2a细胞),其不断分化可逐渐变为细胞株,不再具有瘤细胞的特性,因该细胞能产生大量微管蛋白,并且在神经细胞中起收缩系统作用,本实验室先期发现Aβ25-35对N2a细胞有毒性作用,其毒性片段是AD发病的主要机理之一,会使AD患者脑内Tau蛋白过度磷酸化,因此,本实验继续选用N2a细胞,用它来探究AD的发病机制,为临床治疗AD提供一个新的契点。半枝莲黄酮(Scutellaria barbata flavonoids,SBF)是经从地上部分的半枝莲分离提取所得到的,其药物浓度梯度经本实验室前期研究发现在1.125mg/L、2.25 mg/L和4.5 mg/L范围内较为有效。随着对SBF药理机制研究的不断深入,抗肿瘤、抗老年痴呆、抗机体氧化和降血脂等作用逐渐应用于临床疾病治疗。大量文献研究表明,Tau蛋白磷酸化水平的的高低与AD的罹患率密切相关。本研究室前期研究发现Aβ25-35能够有效诱导N2a细胞的损伤,而SBF对Aβ25-35诱导N2a细胞损伤的关键步骤,即Tau蛋白磷酸化有明显的抑制作用。本研究利用Aβ25-35建立拟AD模型,通过对N2a细胞的Ser199、Ser214、Ser404、Thr231和Thr205这几个位点磷酸化Tau蛋白检测,以及通过对PKA和PP-1活性的调控来探讨SBF对Aβ25-35所致N2a细胞Tau蛋白磷酸化的作用机制。目的:利用蛋白磷酸激酶(PKA)抑制剂H-89和蛋白磷酸酯酶(PP-1)抑制剂OA来探讨Aβ25-35对N2a细胞损伤和Tau蛋白异常磷酸化及半枝莲黄酮干预机制研究。方法:1 N2a细胞的培养:在10%胎牛血清和100μL/m L青霉素的高糖DMEM完全培养液中生长,置于37℃,5%CO2培养箱中孵育,细胞贴壁生长,每天换液,待细胞密度达到80%-90%汇合度时,以1:2进行传代。2 N2a细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放量的测定:利用分光光度法对每组N2a细胞液LDH释放量进行检测。3 MTT法测定N2a细胞的存活率:每孔加100μL终浓度为0.5mg/L的MTT溶液,孵育时间结束后,弃掉MTT溶液,每孔100μL DMSO,最后,用酶标仪对其进行检测。4细胞分组处理:将生长状态较好的细胞随机分为7组:空白组、H-89组、模型组、Aβ25-35+H-89组、SBF低剂量(1.125 mg/L)处理组、SBF中剂量(2.25 mg/L)处理组和SBF高剂量(4.5 mg/L)处理组;将生长状态较好的细胞随机分为7组:空白组、模型组、OA组、Aβ25-35+OA组、SBF低剂量(1.125 mg/L)处理组、SBF中剂量(2.25 mg/L)处理组和SBF高剂量(4.5 mg/L)处理组。5细胞收集:将每组细胞离心完后,弃上清,加入适量PBS,再次离心,弃上清,于-80℃冰箱保存。6提取蛋白:每组细胞加入150μL细胞裂解液,冰上裂解20 min后,进行离心,取上清即为蛋白。7 BCA法蛋白定量:按要求给每组样品加入相应工作液,37℃孵育结束后,冷却,用酶标仪对其进行检测。8蛋白变性:将剩余样品按4:1加入5×蛋白上样缓冲液,100℃沸水变性5 min,冷却,于-20℃冰箱保存。9采用Western blot法检测每组N2a细胞Tau蛋白在Ser199、Ser214、Ser404、Thr231和Thr205这些位点磷酸化蛋白表达水平及PKA和PP-1的蛋白表达水平,研究SBF对Tau蛋白过度磷酸化的调控作用。结果:1利用H-89和OA研究Aβ25-35对N2a细胞损伤及SBF干预图1可见,空白组的细胞在隔夜培养后观察到其胞体完整,细胞膜透亮,细胞形态呈梭形状;模型组是终浓度为40μmol/L的Aβ25-35作用12h,镜下观察到其细胞膜不完整,有破损,细胞出现聚团,细胞凸起不明显,生长缓慢;三剂量SBF药物组分别作用24 h后,镜下观察三组细胞均有不同程度的改善,细胞生长速度较快,细胞膜完整。图2可见,空白组的细胞12 h后观察到其开始迅速繁殖,逐渐融合成片,培养瓶底部已长满;模型组是终浓度为40μmol/L的Aβ25-35作用12 h,100×镜下观察,细胞折光性变差,形态不规则;三剂量SBF药物组分别作用24 h后,镜下观察三组细胞均有不同程度的改善,细胞生长速度较快,细胞形态饱满,细胞膜完整,折光性增强。2利用H-89和OA研究Aβ25-35对N2a细胞LDH释放量和存活率影响及SBF的干预2.1利用H-89和OA研究Aβ25-35对N2a细胞LDH释放量影响及SBF的干预图3可见,与空白组相比,H-89组N2a细胞LDH释放量升高了2.21%(p<0.01),模型组N2a细胞LDH释放量升高了9.4%(p<0.01);与模型组相比,Aβ25-35+H-89组N2a细胞LDH释放量降低了3.31%(p<0.01);与Aβ25-35+H-89组相比,SBF1.125mg/m L组N2a细胞LDH释放量降低了1.98%(p<0.01),SBF2.25mg/m L组N2a细胞LDH释放量降低了1.23%(p<0.01),SBF4.5mg/m L组N2a细胞LDH释放量升高了98.77%(p<0.01)。图4可见,与空白组相比,模型组N2a细胞LDH释放量升高了8%(p<0.01),OA组N2a细胞LDH释放量降低了1.82%(p<0.01);与模型组相比,Aβ25-35+OA组N2a细胞LDH释放量降低了2.64%(p<0.01);与Aβ25-35+OA组相比,SBF1.125mg/m L组N2a细胞LDH释放量降低了2.89%(p<0.01),SBF2.25mg/m L组N2a细胞LDH释放量降低了3.41%(p<0.01),SBF4.5mg/m L组N2a细胞LDH释放量降低了4.34%(p<0.01)。2.2利用H-89和OA研究Aβ25-35对N2a细胞存活率影响及SBF的干预图5可见,与空白组相比,H-89组N2a细胞存活率降低了35.61%(p<0.01),模型组N2a细胞存活率降低了68.75%(p<0.01);与模型组相比,Aβ25-35+H-89组N2a细胞存活率升高了45.17%(p<0.01);与Aβ25-35+H-89组相比,SBF1.125mg/m L组N2a细胞存活率升高了0.97%(p<0.01),SBF2.25mg/m L组N2a细胞存活率升高了19.83%(p<0.01),SBF4.5mg/m L组N2a细胞存活率降低了26.65%(p<0.01)。图6可见,与空白组相比,模型组N2a细胞存活率降低了17.89%(p<0.01),OA组N2a细胞存活率降低了16.82%(p<0.01);与模型组相比,Aβ25-35+OA组N2a细胞存活率升高了23.03%(p<0.01);与Aβ25-35+OA组相比,SBF1.125mg/m L组N2a细胞存活率升高了0.61%(p<0.01),SBF2.25mg/m L组N2a细胞存活率升高了12.89%(p<0.01),SBF4.5mg/m L组N2a细胞存活率升高了25.90%(p<0.01)。3利用H-89和OA探讨SBF抑制Aβ25-35所致N2a细胞Tau蛋白异常磷酸化机制3.1利用H-89和OA研究Aβ25-35对N2a细胞p-Tau(Ser199)影响及SBF干预图7可见,与空白组相比,H-89组N2a细胞中Ser199位点磷酸化Tau蛋白表达水平增加了95.61%(p<0.01),模型组蛋白表达水平升高1.18倍(p<0.01)。与模型组相比,Aβ25-35+H-89组蛋白表达水平降低了22.31%(p<0.01)。与Aβ25-35+H-89相比,SBF低、中剂量组蛋白表达水平分别降低了22.34%(p<0.01)、29.63%(p<0.01),SBF高剂量组蛋白表达水平增加了4.55%(p>0.05)。图8可见,与空白组相比,模型组N2a细胞中PP-1蛋白表达水平增加了13.98%(p>0.05),OA组蛋白表达水平增加了34.28%(p<0.05)。与模型组相比,Aβ25-35+OA组蛋白表达水平增加了13.09%(p>0.05)。与Aβ25-35+OA组相比,SBF低剂量组蛋白表达水平增加了25.80%(p>0.05),SBF中剂量组蛋白表达水平降低了43.51%(p<0.05),SBF高剂量组蛋白表达水平降低了13.24%(p>0.05)。3.2利用H-89和OA研究Aβ25-35对N2a细胞p-Tau(Ser214)影响及SBF干预图9可见,与空白组相比,H-89组N2a细胞中Ser214位点磷酸化Tau蛋白表达水平增加了32.32%(p<0.01),模型组蛋白表达水平增加了53.81%(p<0.01)。与模型组相比,Aβ25-35+H-89组蛋白表达水平降低了18.82%(p>0.05)。与Aβ25-35+H-89相比,SBF三个剂量组蛋白表达水平分别降低了28.29%、20.02%和34.22%,有显著性意义(p<0.01)。3.3利用H-89和OA研究Aβ25-35对N2a细胞p-Tau(Ser404)影响及SBF干预图10可见,与空白组相比,H-89组N2a细胞中Ser404位点磷酸化Tau蛋白表达水平增加了20.94%(p<0.01),模型组蛋白表达水平增加了31.66%(p<0.01)。与模型组相比,Aβ25-35+H-89组蛋白表达水平降低了26.87%(p<0.01)。与Aβ25-35+H-89相比,SBF低剂量组蛋白表达水平增加了2.15%(p>0.05),SBF中、高剂量组蛋白表达水平分别降低了2.49%、13.57%(p>0.05)。图11可见,与空白组相比,模型组N2a细胞中PP-1蛋白表达水平增加了22.72%(p<0.05),OA组蛋白表达水平增加了25.10%(p>0.05)。与模型组相比,Aβ25-35+OA组蛋白表达水平增加了21.40%(p<0.05)。与Aβ25-35+OA组相比,SBF低剂量组蛋白表达水平降低了6.53%(p<0.05),SBF中剂量组蛋白表达水平降低了28.70%(p<0.01),SBF高剂量组蛋白表达水平降低了50.10%(p<0.01)。3.4利用H-89和OA研究Aβ25-35对N2a细胞p-Tau(Thr231)影响及SBF干预图12可见,与空白组相比,H-89组N2a细胞中Thr231位点磷酸化Tau蛋白表达水平增加了32.24%(p<0.01),模型组蛋白表达水平增加了54.19%(p<0.01)。与模型组相比,Aβ25-35+H-89组蛋白表达水平降低了21.92%(p<0.05)。与Aβ25-35+H-89相比,SBF低剂量组蛋白表达水平降低了7.10%(p>0.05),SBF中、高剂量组蛋白表达水平分别增加了16.86%(p<0.01)、5.79%(p>0.05)。图13可见,与空白组相比,模型组N2a细胞中PP-1蛋白表达水平增加了14.23%(p>0.05),OA组蛋白表达水平增加了11.21%(p>0.05)。与模型组相比,Aβ25-35+OA组蛋白表达水平降低了5.23%(p>0.05)。与Aβ25-35+OA组相比,SBF低剂量组蛋白表达水平增加了20.60%(p<0.01),SBF中剂量组蛋白表达水平增加了2.43%(p>0.051),SBF高剂量组蛋白表达水平降低了24.26%(p<0.01)。3.5利用H-89和OA研究Aβ25-35对N2a细胞p-Tau(Thr205)影响及SBF干预图14可见,与空白组相比,模型组N2a细胞中PP-1蛋白表达水平降低了2.29%(p>0.05),OA组蛋白表达水平增加了10.39%(p>0.05)。与模型组相比,Aβ25-35+OA组蛋白表达水平增加了2.26%(p>0.05)。与Aβ25-35+OA组相比,SBF低剂量组蛋白表达水平增加了16.14%(p>0.05),SBF中剂量组蛋白表达水平增加6.99%(p>0.05),SBF高剂量组蛋白表达水平降低了2.86%(p>0.05)。4利用H-89和OA探讨SBF抑制Aβ25-35所致N2a细胞PKA和PP-1的蛋白表达水平图15可见,与空白组相比,H-89组N2a细胞中PKA蛋白表达水平降低了23.77%(p>0.05),模型组蛋白表达水平升高1.88倍(p<0.01)。与模型组相比,Aβ25-35+H-89组蛋白表达水平降低了11.64%(p<0.01)。与Aβ25-35+H-89相比,SBF低剂量组蛋白表达水平降低了20.91%(p>0.05),SBF中、高剂量组蛋白表达水平分别增加了8.41%(p>0.05)、5.72%(p>0.05)。图16可见,与空白组相比,模型组N2a细胞中PP-1蛋白表达水平降低了0.05%(p>0.05),OA组蛋白表达水平降低了21.65%(p<0.05)。与模型组相比,Aβ25-35+OA组蛋白表达水平降低了39.22%(p<0.01)。与Aβ25-35+OA组相比,SBF低剂量组蛋白表达水平升高1.95倍(p<0.01),SBF中剂量组蛋白表达水平增加了89.11%(p<0.01),SBF高剂量组蛋白表达水平升高1.29倍(p<0.01)。结论:1 Aβ25-35能够使AD模型的N2a细胞中PKA蛋白表达水平上升,PKA活性增强,能使每组N2a细胞中Tau蛋白在Ser199、Ser214、Ser404、Thr231这几个位点磷酸化蛋白表达水平增加。2 SBF可通过下调PKA活性来降低Aβ25-35引起的N2a细胞Tau蛋白在Ser199、Ser214、Ser404、Thr231这几个位点磷酸化蛋白表达水平。3 Aβ25-35会使AD模型的N2a细胞中PP-1蛋白表达水平下降,PP-1活性降低,能使每组N2a细胞中Tau蛋白在Ser199、Thr205、Ser404、Thr231这几个位点磷酸化蛋白表达水平升高。4 SBF可通过上调PP-1活性来降低Aβ25-35所致的N2a细胞Tau蛋白在Ser199、Thr205、Ser404、Thr231这几个位点磷酸化蛋白表达水平。5 SBF能够减轻Aβ25-35对N2a细胞的损伤和增加其存活率,降低Ser199、Ser214、Ser404、Thr231和Thr205这些位点的Tau蛋白过度磷酸化,其作用机制是通过降低PKA活性和增加PP-1活性来完成的。