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BRD7是我室自主克隆的一个鼻咽癌候选抑瘤基因,具有阻止细胞周期G1-S期进程、始动细胞凋亡、逆转细胞恶性生物学行为的特征。该基因能结合和识别乙酰化组蛋白H3,是Bromodomain家族成员之一。BRD7通过参与ras/MEK/ERK、Rb/E2F和Wnt等多条信号通路实现抑瘤功能,是一个在鼻咽癌发病过程中与细胞周期和凋亡密切相关的核转录调节因子。尽管BRD7基因抑瘤功能和作用机制研究已经取得了突破性的进展,但仍然缺乏强有力的体内实验依据。新近发展的基因敲除技术是利用同源重组原理使特定的靶基因失活进而实现在其功能缺失的情况下分析靶基因功能的方法。通过基因剔除,可以从整体和细胞水平上反映基因剔除后一系列表型的改变。为此,本课题以C57BL/6小鼠为研究模型,一方面系统比较鼠源性BRD7与人BRD7基因在mRNA序列和氨基酸序列上的同源性,并研究其在小鼠全身各组织中的表达规律；另一方面利用Cre/LoxP系统,探索基因剔除小鼠模型构建和鉴定的方法,构建BRD7条件性剔除小鼠模型,为体内研究BRD7的抑瘤功能、全面考察BRD7参与正常生理、疾病发生的功能和机制奠定坚实基础。具体实验结果如下：一.鼠源性BRD7的序列特征和表达1.鼠源性BRD7的序列特征C57BL是小鼠的一个品系,是一种常见的基因剔除研究动物模型。C57BL小鼠BRD7(mBRD7)的编码框序列为1956bp,含17个外显子,编码651个氨基酸。人BRD7(hBRD7)的编码框序列同为1956bp,含13个外显子,亦编码651个氨基酸。mBRD7的mRNA和氨基酸序列与hBRD7的同源性均高达88%,说明C57BL小鼠中BRD7发挥的功能与人体组织中BRD7发挥的功能类似,是BRD7基因剔除小鼠构建的最佳小鼠品系。2.mBRD7在小鼠全身各组织中的表达规律研究通过数字化表达分析(电子杂交),mBRD7在脑、眼睛、心脏、肝、肺、胰腺、皮肤、睾丸、肠、血液、骨和前列腺等表达水平较高,在肌肉、唾液腺、胃等组织中表达较低,是一个存在广泛表达的保守基因。进一步通过荧光定量PCR检测,发现mBRD7的平均CT值为24.2个循环,GAPDH的平均CT值为19.0个循环,其mRNA表达水平是GAPDH的1/36.76。BRD7在小鼠全身各组织中整体表达处于中低度水平,呈泛表达,但在睾丸、附睾、精囊腺、生精管等雄性生殖相关的组织以及脾、肺、外耳等组织中表达较高,推测BRD7可能与小鼠雄性生育存在某种关联。二.BRD7基因剔除小鼠模型的构建1.BRD7LoxP1-2+/-小鼠的构建和鉴定LoxP插入的杂合子小鼠(Flox小鼠)是条件性基因剔除小鼠过程中的重要步骤,系与上海南方模式生物研究中心合作完成。整个制备过程包括条件性打靶载体的构建、胚胎干细胞的基因打靶、阳性ES细胞克隆的筛选、重组ES细胞囊胚腔注射、嵌合体小鼠的获得等,通过毛色和基因型鉴定获得LoxP插入的杂合子小鼠(BRD7.LoxP1-2+/-小鼠)。在获得BRD7LoxP1-2+/-小鼠的基础上,抽提小鼠尾巴gDNA,分别采用两对针对LoxPl.LoxP2位点的引物和针对野生型等位基因(WT)的引物进行PCR扩增和测序鉴定,证实BRD7LOxP1-2+/-小鼠构建成功。2.BRD7LoxP3+/+小鼠的构建和鉴定取BRD7LoxP1-2+/-小鼠雌雄杂交,分别以子代鼠gDNA为模板,采用针对LOxPl.LoxP2和WT的引物进行PCR扩增鉴定,获得基因型为BRD7LoxP1-2+/+小鼠；然后与E Ⅱ-Cre+/+小鼠杂交,通过PLoxPl、PLoxP2、PLoxP3、PWT和PCre五对引物对子代鼠进行PCR扩增和鉴定,获得基因型为BRD7LoxP3+/-Cre+/-小鼠；再进一步与基因型为BRD7loxP1-2+/-Cre-/-小鼠杂交,获得基因型为BRD7loxP3+/+即理论上的BRD7-/-小鼠。3.BRD7基因剔除(KO)小鼠的鉴定在成功构建BRD7LoxP3+/+(BRD7-/-)小鼠的基础上,采用PLoxP3引物通过PCR扩增LoxP3片段,胶回收纯化片段后直接测序,从gDNA层面证实BRD7的3-4号外显子被成功剔除；进一步以基因型为BRD7LoxP1-2+/+和基因型为BRD7LoxP3+/+小鼠为研究模型,抽提大肠组织总RNA并逆转录,以BRD7全长引物和专针对Exon3-4外显子的引物进行PCR扩增和产物的测序鉴定,从mRNA片段大小和序列特征方面证实BRD7基因剔除小鼠构建成功；最后随机抽取野生型小鼠和基因剔除小鼠各两只,抽提脾脏总RNA并逆转录,从mRNA和多组织层面证明BRD7剔除小鼠构建成功。4.BRD7基因剔除小鼠的大量繁殖为了避免Cre本身对小鼠表型的影响,选择BRD7loxP3+/LoxP1-2+EⅡ-Cre-/-小鼠同胞对之间进行杂交,大量繁殖BRD7基因剔除小鼠。目前已获得BRD7-／-小鼠36只,BRD7+/-小鼠82只,BRD7+/+小鼠90只,为全面探讨BRD7在小鼠中表型和分子机制奠定了坚实基础。综上所述,本研究发现了C57BL小鼠中BRD7与人BRD7具有高度的同源性,均编码651个氨基酸,在小鼠全身各组织中泛表达,但在睾丸、附睾、精囊腺、生精管等雄性生殖相关的组织以及脾、肺、外耳等组织中表达较高。以C57BL小鼠为模型,采用Cre/LoxP系统构建了BRD7基因剔除小鼠模型,探索了一种基因剔除小鼠构建和鉴定的有效方法,大量繁殖了一批BRD7剔除小鼠、杂合子小鼠和野生型小鼠,为全面研究BRD7在体内参与正常生理和疾病发生的过程和机制奠定了坚实基础。