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烯烃和脂肪酸类物质广泛存在于农副产品及其加工副产物中,是化工领域合成与生产中的重要原料。如何实现烯烃和脂肪酸的高值化利用,获得可满足社会需求的高值化产品已成为全球关注的研究热点。相较于传统化学加工技术,酶催化具有低能耗、低污染、反应条件温和、选择性高等优点。但是,酶过于单一的底物适用性,导致单酶催化难以处理复杂反应,极大地限制了其应用。而多酶级联催化技术在简化流程、提高产率、降低成本、减少污染等方面展现了独特优势,是绿色化学领域最具前景的研究方向之一。然而,该技术在烯烃和脂肪酸类物质的高值化利用领域的研究尚处于起步阶段,亟需深度和系统的开发。本研究以催化烯烃和脂肪酸转化的关键酶为核心,构建脂肪酶偶联胆碱氧化酶（AnChOx）、光脱羧酶（CvFAP）的级联催化反应体系,以实现烯烃和脂肪酸类物质的高值化利用,为脂肪酶的级联催化应用拓展提供技术支持,为进一步解决农副产品及其加工副产物、废弃资源高值化利用领域亟待解决的低效率、高能耗、高污染等问题提供科学依据。具体研究内容及结果如下:1.胆碱氧化酶AnChOx的制备及其在天然低共熔溶剂（Natural deep eutectic solvent,NADES）体系中的催化性质研究。首先,在E.coli BL21（DE3）中表达了来源于烟草节杆菌的胆碱氧化酶（Arthrobacter nicotianae Choline oxidase,AnChOx）,并利用亲和层析技术对目标蛋白进行纯化。结果表明:AnChOx重组酶分子量为59.1 kDa,纯酶产量为90 mg L-1,催化氧化氯化胆碱（Choline chloride,ChCl）的比酶活为4.70 U mg-1。其次,研究了AnChOx在NADES体系中催化产生H2O2的能力。结果表明:在NADES体系水分含量50%、pH 7.0、温度40℃、酶添加量5μM,反应时间12 h的条件下,AnChOx催化不同ChCl系列NADES产生的H2O2浓度可达6.41-11.36 mM。2.脂肪酶偶联胆碱氧化酶AnChOx级联催化橙（橘）皮中柠檬烯环氧化反应的研究。在前文研究的基础上,研究了在NADES体系下脂肪酶偶联AnChOx,实现橙（橘）皮中柠檬烯的原位萃取与级联催化环氧化同步耦合过程。首先,以NADES为萃取剂,对橙（橘）皮中的柠檬烯进行原位萃取;与此同时,AnChOx以NADES中的组分ChCl作为底物,原位催化生成H2O2。生成的H2O2在脂肪酶作用下,将辛酸催化氧化成过氧酸;最后,级联催化生成的过氧酸与萃取后的柠檬烯分子中的双键进行环氧化反应生成环氧柠檬烯,通过一锅一步法实现了传统技术需多步反应方能获得的高值化产物。具体研究了12种脂肪酶与AnChOx的级联催化反应特性。结果表明,不同脂肪酶与AnChOx进行级联催化,均可得到环氧柠檬烯产物。当采用固定化脂肪酶Novozyme435与AnChOx级联催化,在NADES体系水分含量50%、pH 7.0、温度40℃、Novozyme435酶添加量25 mg mL-1、AnChOx添加量80μM和辛酸添加量200 mM的条件下,反应24 h后,橙（橘）皮中柠檬烯转化率可达32.94%。3.光脱羧酶CvFAP的制备及其催化脂肪酸脱羧反应研究。首先,在E.coli BL21（DE3）中表达了来自微藻绿球藻中的脂肪酸光脱羧酶（Chlorella variabilis Fatty acid photodecarboxylase,CvFAP）。结果表明:CvFAP重组酶分子量为77.0 kDa,全细胞产量为30 g L-1（湿重）,总蛋白产量为380 mg L-1。其次,研究了CvFAP在粗酶及全细胞形式下催化脂肪酸脱羧反应的能力。结果表明,在温度30℃、pH 8.5、CvFAP全细胞添加量0.35 g mL-1、反应时间24 h的条件下,CvFAP全细胞催化不同链长脂肪酸脱羧转化率为18.34-87.62%,产物浓度可达9.17-43.81mM。相同条件下,粗酶的脂肪酸脱羧产物浓度仅为2.11-17.61 mM,表明CvFAP全细胞催化脂肪酸脱羧反应的效果显著优于CvFAP粗酶（p<0.05）。最后,研究了CvFAP催化的底物选择性。结果表明:在温度30℃、pH 8.5、CvFAP全细胞添加量0.35 g mL-1的条件下,CvFAP同样能以羟基脂肪酸为底物,催化其脱羧生成脂肪醇类化合物。该研究为脂肪酶与CvFAP的级联催化天然/废油脂脱羧反应制备高值化产物奠定了基础。4.脂肪酶偶联光脱羧酶CvFAP级联催化油脂水解及脱羧反应制备烷（烯）烃的研究。在前文研究的基础上,研究了3种脂肪酶与CvFAP进行偶联,将天然/废油脂催化转化为新一代生物燃料——烷（烯）烃的技术。结果表明:在反应温度30℃、pH 8.5、固定化脂肪酶ROL添加量100 mg mL-1、CvFAP全细胞添加量0.35 g mL-1的条件下,反应时间24 h后,产物烷（烯）烃浓度达到74.08 mM,转化率为49.39%。5.脂肪酶偶联光脱羧酶CvFAP级联催化蓖麻油水解及脱羧反应制备脂肪醇的研究。在前文研究的基础上,研究了固定化脂肪酶ROL与CvFAP进行偶联,将价格低廉、资源丰富的蓖麻油催化转化为高级不饱和脂肪醇的技术。结果表明:在温度30℃、pH8.5、固定化脂肪酶ROL添加量50 mg mL-1、CvFAP全细胞添加量0.35 g mL-1的条件下,反应12 h后,产物不饱和脂肪醇浓度达到53.17 mM,转化率为41.70%。综上所述,本研究在两种关键酶（An ChOx和CvFAP）制备的基础上,分别建立了“脂肪酶-AnChOx”和“脂肪酶-CvFAP”级联催化体系,成功实现了烯烃和脂肪酸类物质的高效转化,为农副产品及其加工副产物的高值化利用提供了技术支持,对减少农业废弃物造成的环境污染和资源浪费具有重要意义。