植物花青素具有较好的抗氧化、抗肿瘤和视力保护活性,在维护人类身体健康中发挥重要作用。地黄是传统大宗药材,也是著名的“四大怀药”之一,其近缘种天目地黄、湖北地黄也有长期的民间用药历史。地黄属植物的花含有丰富的梓醇、毛蕊花糖苷、多糖等药效成分,具有重要的开发利用价值。地黄、天目地黄和湖北地黄的花色具有显著的差异,推测花青素种类和含量差异是导致其花色差异的原因。研究地黄属植物花青素形成差异的物质基础,挖掘调控地黄属花青素合成的关键功能基因和分子调控机制,将为地黄属花资源的充分开发利用奠定基础,为地黄种质资源创新和分子育种提供宝贵的基因资源,同时也为研究花青素积累的分子调控提供理论基础。为了研究MYB转录因子在调控地黄、天目地黄和湖北地黄花青素生物合成中的作用,首先测定了3个地黄属植物不同发育阶段花冠中总花青素的含量,并利用花青素靶向代谢组学方法对其花冠中花青素成分进行了定性和定量分析,初步解析了3个物种花冠中花青素差异积累的物质基础。通过转录组测序分别从地黄、天目地黄和湖北地黄中挖掘了可能参与花青素生物合成的结构基因,并鉴定出可能调控花青素生物合成的MYB转录因子。对来自3个地黄属植物的6个MYB基因进行克隆和序列特征分析。构建过量表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑载体,以农杆菌介导的遗传转化对MYB基因调控花青素生物合成的分子功能进行研究。进一步从烟草中克隆了Nt DFR和Nt ANS基因启动子,从地黄、天目地黄和湖北地黄中分别克隆了ANS基因的启动子,并构建了双荧光素酶报告载体,分析了6个MYB转录因子对催化酶基因启动子表达活性的影响。主要的研究内容和结果如下:1.由于天目地黄和湖北地黄实时荧光定量PCR分析的内参基因未见报道,本研究基于天目地黄和湖北地黄5个不同发育阶段的花冠及叶的转录组数据,在两个物种中分别筛选出6个表达量稳定的持家基因作为候选内参基因。通过q RT-PCR分析了候选基因在不同样本内的表达丰度,并利用Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种不同算法对候选内参基因的稳定性进行评估。结果显示,天目地黄中稳定性较高的候选内参基因分别是Rc TIP41和Rc18S,湖北地黄中稳定性较好的候选内参基因是Rh Actin和Rh18S。并且,分别从天目地黄和湖北地黄中筛选了4个功能基因,对内参基因进行了稳定性和准确性验证。通过对定量结果和转录组数据进行相关性分析,证实了Rc TIP41和Rc18S、Rh Actin和Rh18S分别是天目地黄和湖北地黄q RT-PCR分析的最适内参基因。2.对地黄、天目地黄和湖北地黄不同发育阶段花冠及叶中总花青素含量进行测定,发现其总花青素含量呈动态变化。同一发育阶段的总花青素含量存在明显的差异,其中地黄花冠中总花青素含量最高,天目地黄次之,而湖北地黄最少。利用花青素靶向代谢组学分别在地黄、天目地黄和湖北地黄花冠中检测到25、29和26种花青素成分,包括矢车菊素类、天竺葵素类、芍药素类、飞燕草素类和矮牵牛素类花青素。此外,3个物种花冠中含量最高的花青素成分均为矢车菊素-3-O-芸香糖苷,而其在天目地黄中的含量最高(958.14μg·g-1),其次为地黄(812.28μg·g-1),湖北地黄含量最低(431.06μg·g-1)。进一步分别对地黄、天目地黄和湖北地黄的5个时期花冠和叶进行了转录组测序（RNA-Seq）分析,并通过组装分别获得了100,891、91,010和80,035个Unigene。基于转录组数据分别在3个物种中筛选花冠与叶中的差异基因,并从地黄、天目地黄和湖北地黄花冠中鉴定出可能参与花青素生物合成的6种关键催化酶基因。此外,在地黄、天目地黄和湖北地黄转录组中分别鉴定出341、335和315个MYB转录因子基因。以拟南芥At PAP2基因序列作为参考序列,进一步结合不同发育阶段花冠中花青素的积累规律及花青素生物合成酶基因的表达模式,最终在地黄、天目地黄和湖北地黄中鉴定出可能调控花青素生物合成的6个候选MYB基因。3.采用聚合酶链式反应（PCR）分别克隆了地黄的Rg MYB41、Rg MYB42和Rg MYB43基因,天目地黄的Rc MYB1和Rc MYB3基因,及湖北地黄Rh MYB1基因,并利用q RT-PCR分析了6个MYB基因的表达模式。氨基酸序列分析发现,6个MYB转录因子均含有2个SANT超家族MYB结合结构域,属于R2R3-MYB亚家族。分别构建了6个MYB基因的过量表达载体,并利用农杆菌介导法对烟草及地黄属3个物种的叶片进行遗传转化。在烟草中,6个MYB基因的异源表达能够使愈伤组织、幼苗、叶片、花器官等不同器官的颜色明显变红,且花青素含量不同程度的显著提高,其中Rc MYB3基因功能最强。q RT-PCR分析发现,6个MYB基因在烟草中的异源表达能够显著提高花青素生物合成催化酶基因的表达量。与烟草结果相似,MYB基因的过量表达使地黄、天目地黄和湖北地黄植株的叶片、叶脉、块根（根）中总花青素含量及花青素合成酶基因的表达水平均显著提高。功能分析结果证明了6个MYB基因均为花青素生物合成的正调控因子。4.分别采用常规PCR技术或染色体步移法获得了烟草Nt DFR和Nt ANS、地黄Rg ANS、天目地黄Rc ANS和湖北地黄Rh ANS基因的启动子序列。利用启动子分析软件预测发现,5个不同基因启动子序列中均含有MYB结合顺式作用元件。分别构建含有目标启动子序列的双荧光素酶报告载体,将其分别与6个MYB基因同时转染本氏烟草叶片,通过荧光值测定分析来自地黄属的6个MYB转录因子对启动子活性的调控作用。结果表明,转录因子Rg MYB41、Rg MYB42、Rg MYB43、Rc MYB1、Rc MYB3和Rh MYB1均能够显著增强烟草Nt DFR和Nt ANS基因启动子的活性,其调控活性的强度与烟草不同器官中花青素的含量呈正比。此外,地黄、天目地黄和湖北地黄MYB转录因子也均能够增强其内源ANS基因启动子的活性,其调控强度的差异可能与3个地黄属物种花青素含量的差异积累有关。5.为了建立天目地黄的CRISPR/Cas9基因编辑体系,首先利用PCR技术克隆获得了长度为8,041 bp的天目地黄Rc PDS1基因,其编码区长度为1,743 bp,含有14个内含子和15个外显子。进一步在Rc PDS1基因的第4个外显子上设计靶位点并构建了p KSE401:35S:sg Rc PDS1的基因编辑载体。通过农杆菌介导法对天目地黄叶片进行遗传转化,获得了57个抗卡那霉素的再生株系,其中有34个（59.6%）株系具有明显的白化表型。测序发现,具有白化表型植株的Rc PDS1基因靶位点发生了碱基的缺失、替换和插入等不同类型的突变,表明基于CRISPR/Cas9基因编辑可以对天目地黄基因组进行靶向编辑。进一步构建Rc MYB3的基因编辑载体,对其调控花青素生物合成的功能进行研究,并于近期获得了一个花色明显变白且花青素含量显著降低的Rc MYB3基因编辑植株,进一步证明了Rc MYB3基因在正向调控天目地黄花青素生物合成中发挥重要的作用。