目的:本研究利用四个氨基酸(Gly-(D) Ala-Gly-Gly)为螯合剂，对HER2小分子靶向结合蛋白ZHER2∶342进行放射性核素99Tcm标记，制备分子影像探针。探讨核素99Tcm标记ZHER2∶342的最佳制备方法，分析其在体外与HER2受体的结合特性;对该分子探针在HER2高表达SKOV-3荷瘤裸鼠的体内分布及显像进行研究，并与HER2低表达MDA-MB-231荷瘤裸鼠的体内分布及显像进行对比分析，探讨该分子探针在活体内对病灶进行HER2探测的价值及对HER2高表达肿瘤诊断的可行性;并进一步探讨应用99Tcm-ZHER2∶342 SPECT显像在赫赛汀治疗HER2高表达肿瘤疗效评价中的价值。　　方法:　　1.应用Fmoc/tBu多肽固相合成法合成ZHER2∶342，在其N末端连上4个氨基酸[Gly-(D)Ala-Gly-Gly]，其可形成类似N4结构的螯合核素99Tcm的强螯合基团，为消除空间阻碍，在ZHER2∶342和4个氨基酸[Gly-(D)Ala-Gly-Gly]之间引入1个γ-氨基丁酸(γ-Aba)作隔离物，利用配体交换法进行核素99Tcm标记。分析标记物中SnCl2、NaOH的量及反应时间对标记率的影响，探讨最佳的核素99Tcm标记方法。用HPLC测定标记物的标记率与放射化学纯度。分析标记物的体外稳定性及其在体外与HER2高表达人卵巢癌SKOV-3细胞的结合能力及滞留率，并与HER2低表达人乳腺癌MDA-MB-231细胞结合能力及滞留率进行对比分析。同时，在体外应用过量未标记的ZHER2∶342对HER2高表达SKOV-3细胞HER2受体进行预封闭后，与未封闭（未饱和）组进行对比，研究该分子探针与HER2受体结合的靶向特异性。　　2.应用贴壁法培养HER2高表达的人卵巢癌SKOV-3细胞及HER2低表达的人乳腺癌MDA-MB-231细胞。在裸鼠右前肢外侧皮下接种5×106个卵巢癌SKOV-3细胞或MDA-MB-231细胞，制备HER2高表达和低表达肿瘤动物模型。约3～4周后待肿瘤直径长至1～1.5cm，选取肿瘤形态规则，色泽红润，中心无坏死的荷瘤裸鼠模型纳入实验。　　3.取HER2高表达SKOV-3卵巢癌荷瘤裸鼠20只。尾静脉注射99Tcm-ZHER2∶342后分别于1、4、6、8h各处死5只裸鼠，取血液、心、肝、脾、肾、肺、骨、肌肉、胃、小肠、脑及肿瘤组织，电子天平准确称重，测定各组织的放射性计数及不同时间点标准源的总放射性计数，计算每克组织中放射性计数占总放射性计数的百分比（％ID/g）。同时，取HER2低表达的MDA-MB-231乳腺癌荷瘤裸鼠20只按同样方法进行体内分布研究，作为阴性对照，并与HER2高表达SKOV-3荷瘤裸鼠99Tcm-ZHER2∶342体内分布情况进行对比分析。另外，取5只SKOV-3荷瘤裸鼠在尾静脉注射标记物99Tcm-ZHER2∶342之前1h首先注射过量的未标记的ZHER2∶342，使SKOV-3肿瘤组织HER2受体封闭，然后再注射显像剂，4h后进行体内分布研究。与未封闭的SKOV-3荷瘤裸鼠99Tcm-ZHER2∶342体内分布进行对比，评价99Tcm-ZHER2∶342与SKOV-3荷瘤裸鼠肿瘤HER2受体的靶向结合特性。　　4.取HER2高表达SKOV-3卵巢癌荷瘤裸鼠10只，分别于注射显像剂99Tcm-ZHER2∶342后30min、1、2、4、6、12、24h进行SPECT显像。观察随时间延长肿瘤组织放射性浓聚情况，分别计算荷瘤裸鼠在不同时间点肿瘤与对侧同等大小区域的放射性计数的比值，即T/NT比值。同时，取HER2低表达MDA-MB-231乳腺癌荷瘤裸鼠10只，按同样方法进行SPECT显像作为对照。对99Tcm-ZHER2∶342在HER2高表达的SKOV-3卵巢癌荷瘤裸鼠及HER2低表达的MDA-MB-231乳腺癌荷瘤裸鼠体内显像的差异进行对比分析。另外，取5只HER2高表达SKOV-3荷瘤裸鼠，在尾静脉注射显像剂99Tcm-ZHER2∶342之前1h注射过量未标记的ZHER2∶342500μg，使肿瘤组织HER2受体封闭，然后再注射标记物99Tcm-ZHER2∶342,4h后进行SPECT显像。与未进行受体封闭的HER2高表达SKOV-3荷瘤裸鼠显像进行对比，分析标记物99Tcm-ZHER2∶342与SKOV-3荷瘤裸鼠肿瘤HER2受体的体内靶向结合特性。探讨分子探针99Tcm-ZHER2∶342在活体内对病灶进行HER2表达探测的价值。　　5.取HER2高表达SKOV-3荷瘤裸鼠30只，分成三组，每组荷瘤裸鼠10只。治疗1组:腹腔注射曲妥珠单抗注射液（商品名:赫赛汀），共给药两次。第1d给予首次剂量4mg/kg（生理盐水稀释，总体积100uL），第8d给予维持剂量2mg/kg;治疗2组:于第1d行赫赛汀6mg/kg一次性腹腔注射。阴性对照组:分别于第1d及第8d腹腔注射生理盐水100uL。治疗期间每3d测定荷瘤裸鼠的体重、肿瘤体积。应用游标卡尺测量肿瘤的最长径(L)及最短径(D)，肿瘤体积按如下公式进行计算:肿瘤体积=L×D2×1/2。对各组荷瘤裸鼠分别于治疗前、治疗第8、15d进行99Tcm-ZHER2∶342 SPECT显像。尾静脉注射显像剂99Tcm-ZHER2∶3424h后上机检查，进行仰卧位扫描。观察各组SKOV-3荷瘤裸鼠肿瘤放射性浓聚情况。同时，利用感兴趣区技术(Region of Interest，ROI)，分别计算各组荷瘤裸鼠肿瘤与对侧同等大小区域的放射性计数的比值，即T/NT（target to nontarget ratios）比值，对治疗组和对照组进行对比分析。于治疗第15d SPECT显像结束后，处死各组荷瘤裸鼠，取出肿瘤组织，观察肿瘤组织大体形态，分别对各组肿瘤组织进行免疫组化分析，观察各组肿瘤组织治疗后HER2表达情况。对各组治疗后第15d荷瘤裸鼠99Tcm-ZHER2∶342 SPECT显像T/NT比值与相应肿瘤组织HER2表达水平进行相关性分析，分析99Tcm-ZHER2∶342 SPECT显像在赫赛汀治疗HER2高表达肿瘤疗效评价中的价值。　　结果:　　1.99Tcm标记ZHER2∶342的最佳方法为反应体系中依次加入ZHER2∶3425μg(1g/L)、NaOH5μg(1g/L)、SnCl28.8μg(1g/L)、99TcmO4-150μL(37MBq),轻微震荡后室温静置60min。99Tcm-ZHER2∶342标记率为98.10±1.73％(n=5)。标记物99Tcm-ZHER2∶342与生理盐水及人新鲜血清混合24h放射化学纯度均在85％以上。标记物在体外与HER2高表达的人卵巢癌SKOV-3细胞具有较高的结合率，6h最高，结合率为9.95±1.02％。在1、2、4、6、12、24h与HER2高表达人卵巢癌SKOV-3细胞的结合率均明显高于HER2低表达的人乳腺癌MDA-MB-231细胞（t值分别为:-23.810、-23.930、-33.870、-13.140、-34.500及-21.280，P值分别为:0.001、0.000、0.000、0.004、0.000及0.000）。此外，加入过量未标记的ZHER2∶342对SKOV-3肿瘤细胞HER2受体进行封闭后，分子探针与SKOV-3细胞的结合率从9.95±1.02％降至2.11±0.27％，差异有显著性(t=-13.140，P=0.004)，表明分子探针99Tcm-ZHER2∶342与HER2受体的结合具有特异性。　　2.荷瘤裸鼠的体内分布结果显示，HER2高表达SKOV-3荷瘤裸鼠肿瘤组织对标记物99Tcm-ZHER2∶342的摄取随着时间延长逐渐增加，以6h最高。4、6、8h肿瘤摄取值明显高于1h，而4、6、8h之间无明显差异（应用成组设计多样本比较的秩和检验进行统计学分析，x2=11.972，P=0.008)。除肿瘤外，99Tcm-ZHER2∶342在肾脏中的放射性分布最高。在血液、心脏、骨骼、肺脏和肌肉组织内放射性分布非常低。HER2高表达SKOV-3肿瘤组织摄取99Tcm-ZHER2∶342在各时间点均明显高于HER2低表达MDA-MB-231肿瘤组织，差异有显著性。1、4、8h组间比较应用成组设计两样本比较的秩和检验，Z值分别为2.858、-3.123、-3.123，P值分别为0.004、0.002、0.002）;6h组间比较应用t检验，t=-13.180，P=0.002。在注射标记物前1h注射过量的未标记的ZHER2∶342使SKOV-3肿瘤细胞HER2受体封闭，4h后行体内分布研究，肿瘤摄取值从8.22±1.41降至0.97±0.22％ID/g，经统计学分析，差异有显著性(t=8.800，P=0.012)，表明标记物99Tcm-ZHER2∶342在体内与HER2高表达荷瘤裸鼠肿瘤的结合是HER2受体特异性结合。　　3.荷瘤裸鼠99Tcm-ZHER2∶342 SPECT显像结果示:HER2高表达SKOV-3荷瘤裸鼠SPECT显像30min时即可看到标记物在肿瘤组织部位特异性聚集，且随着显像时间延长，放射性聚集程度逐渐增加。6h时肿瘤摄取最明显，与荷瘤裸鼠体内分布一致，24h时仍可看到肿瘤组织的摄取。T/NT值以6h最高，但4、6h T/NT比值间未见统计学差异(t=-0.280，P=0.794)。除肿瘤外，可看到两侧肾脏有明显的放射性核素聚集。而可摄取游离99Tcm的甲状腺部位未见明显放射性浓聚。HER2低表达的MDA-MB-231荷瘤裸鼠肿瘤部位30min、1、2、4、6、12、24h均未见明显放射性核素聚集，T/NT值明显低于HER2高表达的SKOV-3荷瘤裸鼠，差异具有显著性（t值分别为:3.580、8.630、4.420、5.030、6.010、3.190及3.520，P值分别为0.023、0.001、0.012、0.007、0.004、0.033及0.025）。HER2高表达SKOV-3荷瘤裸鼠提前注射过量未标记的ZHER2∶342使HER2受体封闭后再进行SPECT显像，各时间点均未看到肿瘤组织摄取，表明未标记的ZHER2∶342可将SKOV-3肿瘤组织的HER2受体进行封闭，标记物99Tcm-ZHER2∶342与SKOV-3荷瘤裸鼠肿瘤在体内具有HER2靶向结合特性。　　4.对HER2高表达SKOV-3荷瘤裸鼠的阴性对照组、赫赛汀治疗1组及赫赛汀治疗2组荷瘤裸鼠进行相应治疗，于治疗结束后，将各组荷瘤裸鼠处死。各组荷瘤裸鼠体重在治疗期间均逐渐增加，经统计学分析，差异无显著性(F=0.580，P=0.572)，表明赫赛汀治疗对荷瘤裸鼠生长无明显影响。各组荷瘤裸鼠移植瘤体积在治疗期间均逐渐增大，但治疗1、2组移植瘤生长缓慢。治疗结束时治疗1、2组与阴性对照组间移植瘤体积可见明显差异，而治疗1、2组间未见明显差异(F=109.930，P=0.000)。　　5.阴性对照组、治疗1组及治疗2组的HER2高表达SKOV-3荷瘤裸鼠分别于治疗前、治疗后第8、15d行99Tcm-ZHER2∶342 SPECT显像。从图像可以看出，治疗前各组荷瘤裸鼠肿瘤部位均可见放射性核素浓聚，治疗1、2组经赫赛汀治疗后肿瘤摄取程.度减低。赫赛汀治疗1、2组中，治疗后第8、15d T/NT比值均较治疗前减低，而治疗后第15d T/NT比值较治疗后第8d亦明显减低(应用方差分析法进行统计学分析，治疗1组F=35.87，P=0.000;治疗2组F=20.780，P=0.000)。赫赛汀治疗1、2组间治疗后第8d及第15d的T/NT比值比较，无统计学差异（t值分别为0.300、1.010，P值分别为0.765、0.328）。阴性对照组荷瘤裸鼠治疗期间T/NT比值轻度增加。治疗后14天肿瘤组织HER2表达检测结果:阴性对照组10例均表现为强阳性(+++);治疗1组阳性1例，弱阳性7例，阴性2例;治疗2组阳性2例，弱阳性6例，阴性2例。同阴性对照组相比，治疗1、2组HER2表达明显降低，差异有显著性（X2分别为17.148、16.844，P=0.000、0.000），表明赫赛汀对HER2高表达的SKOV-3荷瘤裸鼠有明显的治疗作用，可明显下调HER2的表达水平。而治疗1、2组间HER2表达无明显统计学差异（x2=0.128、P=0.721）。对各实验组治疗后第15天荷瘤裸鼠99Tcm-ZHER2∶342体内SPECT显像T/NT比值与相应肿瘤组织的HER2表达水平进行相关性分析，结果表明，相关系数rs=0.919，P=0.000，荷瘤裸鼠99Tcm-ZHER2∶342 SPECT显像T/NT比值与肿瘤组织HER2表达水平存在明显的正相关。　　结论:　　1.本研究制备分子影像探针核素99Tcm标记的HER2小分子靶向结合蛋白 ZHER2∶342，该标记方法简单，标记率高，体外稳定，在体外可与HER2高表达的人卵巢癌SKOV-3细胞HER2受体特异性结合，是一个很有潜力的分子影像探针。　　2.分子探针99Tcm-ZHER2∶342具有良好的体内分布， HER2高表达SKOV-3荷瘤裸鼠肿瘤摄取明显，血液清除快，图像质量高。HER2高表达SKOV-3荷瘤裸鼠肿瘤摄取明显高于HER2低表达的MDA-MB-231荷瘤裸鼠肿瘤摄取。提前注射过量未标记的ZHER2∶342后HER2高表达肿瘤组织未见明显摄取，表明标记物99Tcm-ZHER2∶342在体内与SKOV-3荷瘤裸鼠肿瘤HER2受体具有良好的靶向结合特性。分子探针99Tcm-ZHER2∶342在活体内对病灶HER2表达的探测是可行的。　　3.赫赛汀对HER2高表达的人卵巢癌SKOV-3荷瘤裸鼠具有明显的治疗作用，明显下调肿瘤组织HER2的表达水平。99Tcm-ZHER2∶342 SPECT显像T/NT比值下降与HER2受体表达降低表现出良好的正相关。99Tcm-ZHER2∶342 SPECT显像在赫赛汀治疗HER2高表达肿瘤疗效评价方面具有重要价值。