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果胶酶是催化分解果胶质的多种酶的总称。按其作用的最适pH,果胶酶可分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。酸性果胶酶广泛应用于提取果汁和酒类,以及饲料工业。碱性果胶酶则在油提取、植物药提取、植物纤维加工、纺织、造纸、洗涤剂、茶和咖啡发酵、含果胶工业废水处理及生物技术等方面的应用越来越受到关注。在工业化应用中,由于酶的pH适应范围窄,则需要更多的技术来维持反应体系中酶的稳定,同时也需要大量的酸或碱来中和,这就造成成本高、用水量大、能耗高、耗时长,废液中COD值高等问题,同时果胶酶的高效性、多用性的研究也迫在眉睫。因此,获得更加高效、底物特异性更强、酶学性质更加稳定的果胶酶,就成为果胶酶有效应用的关键。本研究前期利用PCR技术从Bacillussubtilis 168扩增获得碱性果胶酶基因pel168。该基因含有1263bp的ORF,编码420个氨基酸,利用Signal P分析得到该氨基酸序列含有21个氨基酸的信号肽。将该基因pel168在大肠杆菌Rosset Blue(DE3)中进行了诱导表达,重组蛋白表征结果表明,该碱性果胶酶的最适温度为50℃,最适pH为9.4。但是,这种碱性果胶酶的比酶活不高,pH为3～6时,相对活性也降低了 40%。因此,本研究对碱性果胶酶PEL168进行了理性设计,利用PyMol等辅助软件对果胶酶PEL168的三级结构进行分析,推测出三种方案:1)将第26位的K和27位的A分别突变成E和D,目的是和第5位的H形成盐桥,增加末端的紧密度;2)将第132位的缬氨酸V突变成带苯环的氨基酸,可以增强疏水性;3)在第二方案的基础上,再将第3位L突变成带苯环的氨基酸,进行双突变表达分析。于是设计突变引物进行定点诱变,研究其蛋白突变对其结构和功能的影响。在第一方案中,将第26位的赖氨酸K和27位的丙氨酸A分别突变成谷氨酸E和天冬氨酸D,获得突变体后,对其酶活性进行了初步研究,研究发现,获得的突变体完全丧失酶活;在第三方案中,当在第二方案的基础上,再将第3位亮氨酸L突变成苯丙氨酸F,获得突变体后,对其酶活性进行了初步研究,研究发现,获得的突变体和原始蛋白相比较,酶的活性大幅降低;而对于第二种方案,将该碱性果胶酶PEL168基因的457位的鸟嘌呤G变成胸腺嘧啶T,获得pe1168V132F,使得其编码氨基酸序列成熟肽的第132位的缬氨酸V(GTC)突变成苯丙氨酸F(TTC)。分别将原始基因pel168和突变基因pel168V132F在大肠杆菌Rosset Blue(DE3)进行诱导表达,随后对表达产物进行了镍柱亲和层析法与离子交换层析纯化,最后再比较果胶酶原始蛋白PEL168和突变体PEL168V132F的酶学性质,发现果胶酶突变体PEL168 V132F比原始果胶酶PEL168在pH为3、5、6时,相对活性有显著提高,同时比酶活也是原始果胶酶PEL168的2.25倍。此外,为了让该果胶酶在酵母中的表达水平更高,我们将前期根据毕赤酵母密码子的偏爱性及简并性优化的pel168s基因更换了表达载体,将原始毕赤酵母表达载体pHBM905A更换为信号肽和启动子更优的质粒载体BDM,构建重组质粒BDM-pel168s后转入毕赤酵母GS115中,对异源蛋白(PEL168S)进行诱导表达。挑选更换载体前后具有相同拷贝数的毕赤酵母重组菌株,在相同的培养条件下,使用甲醇诱导96h,发现BDM-PEL168S的酶活比pHBM905A-PEL168S提高了 47%。利用荧光定量PCR技术进行mRNA水平的研究,结果表明,更换表达载体后的毕赤酵母重组菌株mRNA表达水平比更换前提高了 27%。