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背景:喉癌占全身恶性肿瘤的1%～5%,是头颈部最常见的肿瘤之一,占头颈部肿瘤的13.9%,我国部分地区发病率约为1.5～3.4/10万人,已成为严重威胁人民生命健康和生活质量的疾病,以鳞癌多见。虽然近几十年来传统的治疗方式如手术、放疗、化疗等已有很大改进,提高了患者的五年生存率,但手术治疗易使患者的喉功能严重破坏而致残;放疗仅对早期喉癌疗效好,对于大多数就诊时即为中、晚期或治疗后又出现复发、转移的患者往往效果不佳;而化疗又由于毒副作用严重常使得患者无法耐受,从而使这些治疗方式仍受到很大限制。因此,积极寻求治疗喉癌的新途径即成为耳鼻咽喉科研究者面临的新课题。肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)是一种多功能的细胞因子,为一种多肽,其生物学活性由c-Met蛋白所介导。c-Met蛋白属酪氨酸激酶活性的生长因子受体,研究发现其在促进细胞增殖分化、细胞扩散、新生血管的生成方面具有重要作用。异常表达的c-Met激活下游分子导致肿瘤的发生、发展和转移。研究表明c-Met在喉癌中强表达,与喉癌的增殖及转移关系密切。RNA干扰技术具有特异、有效的基因沉默效应,能够简单、高效地抑制特定基因的表达,目前已成为肿瘤基因治疗研究的热点。本研究构建了表达c-Met shRNA的重组质粒pSilencer2.0/c-Met-shRNA,并在脂质体的介导下转染人喉癌Hep-2细胞株。应用RT-PCR及Western-Blot技术,比较研究了转染前后c-Met表达的变化;并通过MTT法、运动实验及侵袭实验比较转染前后Hep-2细胞的生长、运动及侵袭能力,考察c-Met基因成为喉癌治疗的靶基因的可行性。目的:设计以人c-Met基因为靶向的shRNA,构建携带此shRNA的重组质粒,检测其转染人喉癌Hep-2细胞后抑制c-Met mRNA及蛋白表达的效应,筛选RNAi作用最强的shRNA片段。并探讨c-Met-siRNA在体外对Hep-2细胞生长、运动、侵袭的影响。方法:1.设计3对针对c-Met基因不同位点的shRNA片段,退火形成双链DNA,再与经双酶切后的载体Psilencer2.0-U6连接,构建携带此shRNA的重组质粒pSilencer2.0/c-Met-shRNA,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定,并进行序列测定。2.利用构建成功的重组质粒,通过脂质体介导的方法将其转染到喉癌Hep-2细胞株中。采用RT-PCR及Western-Blot法检测c-Met mRNA及蛋白表达情况,比较转染前后其表达的变化,判断各shRNA的干扰效应;筛选出抑制效果最好的c-Met-siRNA序列。3.通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法(取转染后细胞生长24h、48h、72h、96h四个时间点)、运动实验及侵袭实验(通过构建transwell小室)比较重组质粒转染Hep-2细胞前后细胞的生长、运动及侵袭能力。结果:1.重组质粒转化DH5α菌株经氨卞青霉素抗性筛选可见有细菌克隆长出。2.双酶切鉴定显示重组质粒含有BamHⅠ及HindⅢ酶切位点。3.经测序,模板序列与设计序列完全正确,重组质粒构建成功。4.通过脂质体转染三种干扰质粒后,RT-PCR法检测c-Met基因的mRNA表达水平,显示三组均下调,以重组质粒pSilencer2.0/c-Met-shRNA2效应最显著(p=0.003)。5.经Western-Blot法检测,通过脂质体转染三种干扰质粒后,c-Met蛋白的表达水平均下调,以重组质粒pSilencer2.0/c-Met-shRNA2效应最显著(p=0.02)。6.pSilencer2.0/c-Met-shRNA2转染Hep-2细胞后,相对于未转染组及空质粒转染组,细胞在培养24h、48h、72h、96h后的吸光度A492值均显著下降(p<0.05)。7.pSilencer2.0/c-Met-shRNA2转染Hep-2细胞后,相对于未转染组及空质粒转染组,侵袭细胞计数为15.00±3.61( p值均=0.004),趋化运动细胞计数为72.67±4.73(分别为p=0.001,p=0.004)。结论:1.成功构建了针对c-Met基因的重组RNAi质粒pSilencer2.0/c-Met-shRNA1、pSilencer2.0/c-Met-shRNA2、pSilencer2.0/c-Met-shRNA3。2.重组质粒pSilencer2.0/c-Met-shRNA2可明显降低喉癌Hep-2细胞c-Met基因在mRNA和蛋白水平的表达。3.重组质粒pSilencer2.0/c-Met-shRNA2能显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动及侵袭,有可能是潜在的喉癌治疗新方法。