研究背景和目的：　　慢性压迫性脊髓损伤是脊髓长期受到渐进行压迫而出现的一类临床多发的中枢神经系统慢性损伤性病变，多见于脊柱退行性疾病，如颈椎病、椎间盘突出症、椎管狭窄症和后纵韧带骨化症等。随着人类平均寿命的延长及生活和工作方式的改变，该疾病的发病率逐年上升，发病人群年轻化。脊髓慢性持续性受压产生的各种病理生理改变，导致受压部位以下运动、感觉和（或）自主神经功能不可逆性障碍，甚至永久性的残疾，包括瘫痪、感觉丧失、神经性疼痛和直肠膀胱功能障碍等，严重影响患者的生活质量和社会功能，给患者及其家庭带来巨大的经济损失和心理生理负担。目前，针对慢性压迫性脊髓损伤的治疗开展了广泛的临床治疗研究，主要包括持续压迫的手术减压、不稳定病变的融合稳定、药物治疗（如激素冲击治疗、清除自由基和抑制炎症反应等）、继发症和并发症的管理，以及后续的康复治疗等。上述治疗方案虽然不同程度缓解脊髓损伤的病理改变，延缓了慢性脊髓损伤患者整体结局，但对于严重的脊髓慢性损伤患者(AISA分级为A、B和C级)，上述方案所取得的疗效相当有限，仅靠解除压迫、药物治疗及机体自身的能力无法完全修复脊髓不可逆性的损伤和恢复神经系统功能障碍。因此，寻求有效修复脊髓损伤的治疗方法仍然是困扰临床医生的难题。　　近年来，干细胞移植为慢性脊髓损伤的治疗带来新的思路，对于受压脊髓局部病理生理环境改善和患者神经功能恢复具有很大的潜力，是目前非常有前景的治疗策略。脂肪干细胞(Adipose derived stem cells，ADSCs)是从脂肪组织中分离得到的一种具有稳定增殖和多向分化潜能的成体干细胞(Adult stem cells，ASCs)。脂肪储存是可补充的、丰富的、可以大量获取并对病人造成最小不适，吸脂手术与骨髓抽吸相比，脂肪干细胞分离创伤更小，更容易让患者接受。吸脂及手术区域部分脂肪组织通常被认为是医学废物最后丢弃，这是一个很好的自体ADSCs来源，逐渐成为再生医学和组织工程研究热点之一。研究表明，脂肪干细胞在特定的诱导条件下，具有分化成不同胚层来源细胞的潜能，如中胚层来源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，外胚层来源的神经细胞、表皮细胞，内胚层来源的肝细胞、内皮细胞、分泌胰岛素的β样细胞等。Safford等在2002年首次在含有丙戊酸、丁基羟基茴香醚、胰岛素、氢化可的松的培养基中，诱导第4-5代的脂肪干细胞向神经元形态转变，并表达神经表型GFAP、Nestin和NeuN。最近研究表明脂肪干细胞在特定诱导条件下能够形成神经细胞谱系，因此构建定向诱导脂肪干细胞形成神经细胞谱系的培养体系对于慢性脊髓损伤的治疗具有非常重要的意义和潜在的临床应用价值。本研究的目的:分离、培养和鉴定大鼠ADSCs，并通过成骨和成脂诱导检测其多能性;采用小分子化合物Dorsomorphin、CHIR99021、SB431542、维甲酸(Retinoic acid，RA)和丙戊酸钠(Sodium Valproate，VPA)时序性调控ADSCs神经分化的信号通路，建立诱导ADSCs形成神经祖细胞(Neural progenitor cells，NPCs)的平面培养体系，并进一步诱导其形成神经元样细胞;建立慢性压迫性脊髓损伤大鼠模型，并通过神经功能行为学评分和运动诱发电位检测评估该模型;Ad-GFP腺病毒标记的ADSCs和NPCs损伤部位原位移植，探究ADSCs及其分化的NPCs对慢性压迫性脊髓损伤修复以及在体神经分化。　　研究方法：　　(1)从大鼠附睾旁和腹股沟脂肪组织中利用酶消法分离ADSCs，体外扩增培养ADSCs，细胞流式技术鉴定ADSCs的免疫表型CD29、CD90、CD34和CD11b;并使用成骨诱导培养基（HG-DMEM培养基中添加10％FBS、0.1μM地塞米松、0.5μM抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸钠）和成脂诱导培养基（HG-DMEM培养基中添加10％FBS、0.5mM IBMX、0.2mM吲哚美辛、0.1μM地塞米松和10μM胰岛素）诱导ADSCs成骨和成脂分化，诱导21天后分别行茜素红染色和油红O染色，测定ADSCs的多能性。　　(2)使用小分子化合物Dorsomorphin、CHIR99021、SB431542、维甲酸(Retinoicacid，RA)和丙戊酸(Valproic acid，VPA)干预ADSCs神经分化的信号通路，模拟神经发育过程，构建阶段性诱导ADSCs阶段性形成神经细胞谱系的培养体系。ADSCs在第一诱导阶段完全培养基(DMEM/F12(LG)中添加10％FBS、2μMDorsomorphin、3μM CHIR99021和2μM SB431542）中培养，采用细胞免疫荧光、western blot和RT-PCR分别检测DMSO对照组和诱导组各诱导时间段(诱导12h、24h、3d、3d和6d)神经祖细胞(Neural progenitor cells，NPCs)标志物Pax6和Sox1蛋白和mRNA的表达。随后，第一诱导阶段形成的NPCs在第二诱导阶段完全培养基(DMEM/F12(LG)中添加10％FBS、2μM Dorsomorphin、1μMCHIR99021、2μM SB431542、0.1μM RA和0.5μM VPA）中培养6天，采用细胞免疫荧光、western blot和RT-PCR检测对照组和诱导组NeuroD1、ChAT蛋白和mRNA的表达。最后，在第二诱导阶段形成的运动神经元前体细胞(Motor neuronprecursor cells，MNPs)在第三诱导阶段完全培养基(DMEM/F12(LG)中添加10％FBS、0.5μμM RA和0.5μM VPA）培养6天，采用细胞免疫荧光、western blot和RT-PCR检测对照组和诱导组ChAT、βⅢ-tubulin的表达。　　(3)随机将50只SD大鼠（雄性，180±20g）分为正常对照组(n=10)、假手术组(n=10)和慢性压迫组(n=30)。改进螺丝钉压迫建模方法，设计一种简便和易于操作的胸椎后路钛金属压迫装置，手术将压迫装置植入大鼠背部，使钛压迫垫片与T10段脊髓接触。慢性压迫组于术后24h、1w、2w、3w、4w、5w、6w将钛螺丝拧入0.2mm，造成对脊髓的慢性持续性压迫。假手术组只植入压迫装置，不拧入钛螺丝，其余与压迫组一致。正常对照组不进行手术操作，其余与假手术一致。分别于术前、术后24h、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w拧入钛螺丝前行BBB评分。各组大鼠在术前和术后1w、2w、4w、6w和8w行经颅电刺激运动诱发电位(Motor evoked potentials，MEP)检测，计算MEP潜伏期和波幅。造模后4w和8w各组大鼠随机选取5只，取受压脊髓行病理学染色和βⅢ-tubulin免疫组化染色观察脊髓病理变化。　　(4)采用1×108PFU/ml的Ad-GFP腺病毒转染ADSCs和NPCs，稳定转染后24h，细胞计数，并用DMEM/F12重悬细胞，浓度为1×105/5ul。在慢性压迫性脊髓损伤大鼠模型稳定建立后8w，研究ADSCs和NPCs对慢性压迫性脊髓损伤的修复效应。将20只慢性压迫性脊髓损伤大鼠随机分为4组，压迫对照组(n=5)大鼠不给于手术减压和细胞移植;减压+DMEM组(n=5)行手术减压治疗，并在损伤部位注射5ul DMEM/F12作为对照;减压+ADSCs组(n=5)行手术减压和损伤部位注射ADSCs(1×105/5ul);减压+NPCs组(n=5)行手术减压和损伤部位注射NPCs(1×105/5ul)。分别在细胞移植前和细胞移植后24h、1w、2w、4w对各组大鼠行BBB评分，在移植后2w和4w行MEP检测，评估神经功能恢复情况。细胞移植后后4w各组大鼠脊髓组织取材，行GFP和βⅢ-tubulin免疫荧光染色，观察各组大鼠神经元存活和脊髓修复情况，探究移植细胞的在体神经分化。　　研究结果：　　(1)原代ADSCs在分离后培养的第9天细胞融合约90％左右，细胞呈成纤维细胞样梭形、放射状排列。传代后3-5天细胞可增殖至90％左右。细胞流式分析ADSCs免疫表型结果:第3代ADSCs的CD29阳性率98.3％、CD90阳性率98.4％，而CD34阳性率为0.79％、CD11b阳性率为1.08％。ADSCs分别在成骨和成脂分化培养基中诱导21天后，成骨分化细胞可见典形的矿化结节形成，并且被茜素红染成橘红色;成脂分化细胞油红O染色显示脂滴被染成大小不等的圆形，聚集在细胞边缘。　　(2)使用Dorsomorphin、CHIR99021、SB431542、RA和VPA阶段性诱导ADSCs形成神经细胞谱系，第一诱导阶段培养2d、3d和6d，western blot和RT-PCR结果表明神经祖细胞标志物Sox1和Pax6蛋白和mRNA表达量显著升高（与DMSO组相比，P＜0.01），并且在第3天达到最高，细胞免疫荧光显示在诱导的第3天，Sox1和Pax6阳性细胞比例大于90％。在第二诱导阶段，NPCs诱导6天后，westernblot和RT-PCR结果表明早期神经元标志物NeuroD1和胆碱能神经元标志物ChAT蛋白和mRNA的表达量显著升高（与对照组，P＜0.01），细胞免疫荧光显示NeuroD1和ChAT阳性细胞比例大于90％。在第三诱导阶段，MNPs诱导6天后，神经元标志物βⅢ-tubulin和ChAT的表达量显著增加，细胞免疫荧光显示细胞向两极形成长的突起，形态与运动神经元相似。　　(3)在慢性压迫性脊髓损伤建模后1w、2w、3w、4w、5w、6w和7w，BBB评分持续性下降（和假手术相比，P＜0.01），造模后7周以后BBB评分呈稳定状态。经颅电刺激运动诱发电位检测表明:MEP潜伏期逐渐延长，造模2w后潜伏期与假手术存在差异(P＜0.05); MEP波幅逐渐减低，造模4周后与假手术组存在差异(P＜0.05)。病理和免疫组化染色结果表明:模型组的脊髓呈慢性损伤改变，随压迫时间延长，脊髓前角βⅢ-tubulin阳性神经元数量显著减少（和假手术相比，P＜0.01）。　　(4)Ad-GFP腺病毒转染ADSCs和NPCs，稳定转染24h后转染率达到大于80％。细胞移植后BBB评分结果显示:与压迫对照组相比，减压+DMEM组神经功能行为学无明显改善(P＞0.05);减压+DMEM相比，减压+ADSCs组在细胞移植后2周神经功能行为学出现改善(P＜0.05)，在移植后4周明显改善(P＜0.01)，而减压+NPCs组在移植后2周神经功能行为学出现明显改善(P＜0.01)。，减压+ADSCs组(13.25±0.50)和减压+NPCs组(14.25±0.96)在移植后4周存在差异(P＜0.05)。经颅电刺激运动诱发电位结果显示:和压迫对照组相比，减压+DMEM组和减压+ADSCs组MEP潜伏期在减压术后4周改善(P＜0.05)，而减压+NPCs组MEP潜伏期明显改善(P＜0.01)。减压+ADSCs组和减压+NPCs组无明显差异(P＞0.05)。MEP波幅变异大，不推荐作为评价神经功能恢复的指标。组织免疫荧光显示:压迫组脊髓前角βⅢ-tubulin阳性神经元数量很少，神经纤维排列紊乱，脊髓空洞明显。与压迫组相比，减压+DMEM组和减压+ADSCs组脊髓病理改变有改善，βⅢ-tubulin阳性神经元数量存在差异(P＜0.05)。与减压+DMEM组相比，减压+NPCs组在细胞移植后4周，脊髓病理改变明显改善，脊髓空洞被GFP阳性细胞填充，βⅢ-tubulin阳性神经元数量增加(P＜0.05)。减压+ADSCs组和减压+NPCs组都未检测到GFP/βⅢ-tubulin双阳性的细胞，两组脊髓前角都存在较多GFP阳性细胞，且数量无差异(P＞0.05)。但减压+NPCs组GFP阳性细胞体积较大，形态呈双极状。　　研究结论：　　(1)从大鼠脂肪中提取ADSCs，具有成体干细胞免疫表现，并能够在体外稳定增殖，并有成骨和成脂分化的潜能。　　(2)小分子化合物Dorsomorphin、CHIR99021、SB431542、RA和VPA调控脂肪干细胞神经分化的多条信号通路，模拟神经发育过程，阶段性诱导ADSCs向神经细胞谱系转分化，在第一诱导阶段培养3天后ADSCs形成Pax6和Sox1阳性的神经祖细胞(Neural progenitor cells，NPCs)，在第二诱导阶段形成NeuroD1和ChAT阳性的运动神经元前体细胞(Motor neuron precursor cells，MNPs)，分化比率大于90％。在第三诱导阶段培养6天后，形成ChAT和βⅢ-tubulin阳性的运动神经元样细胞，但还需细胞膜片钳检测是否具有神经元膜电位特性。　　(3)改进螺丝钉压迫法，设计慢性压迫装置，建立慢性压迫性脊髓损伤大鼠模型，并通过神经功能行为学评分和经颅电刺激运动诱发电位检测表明该模型符合慢性压迫性脊髓损伤特点。　　(4)减压手术联合ADSCs及其诱导形成的NPCs的移植，相比单纯减压手术，能够更好地改善慢性压迫性脊髓损伤大鼠神经功能，修复脊髓损伤，NPCs移植对慢性脊髓损伤的修复更明显。在移植后4周检测到两种细胞在大鼠脊髓中存活，但未检测到GFP/βⅢ-tubulin双阳性的细胞，说明移植后4周NPCs和ADSCs都在体内未分化形成神经元。ADSCs和NPCs移植对慢性压迫性脊髓损伤修复的机制还需要更长时间的观察和进一步的研究。