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目的:研究miR-126调控内皮祖细胞及对静脉血栓溶解、机化和再通的影响,为慢性深静脉血栓的治疗提供一种新的治疗思路。方法:首先分离、培养及鉴定骨髓源性内皮祖细胞,将miR-126模拟物、抑制剂或阴性对照物用电转的方法转染到内皮祖细胞中,采用MTT、流式细胞术检测miR-126对内皮祖细胞增殖及细胞周期的影响;采用划痕实验、穿膜实验检测miR-126对内皮祖细胞运动迁移能力的影响;采用matrigel管腔形成实验检测miR-126对内皮祖细胞成小管能力的影响。进一步预测miR-126靶基因PIK3R2,并构建包含野生型PIK3R23’UTR和突变体PIK3R23’UTR的Luciferase报告基因载体,检测miR-126对PIK3R2的直接调控作用,Western blot分析PIK3R2蛋白以及PI3K/AKT信号通路中PI3K、Akt和p-Akt蛋白的变化。再构建miR-126慢病毒表达载体(pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-126),HEK293T细胞包装、重组、扩增慢病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达, PCR、双酶切、基因测序进行鉴定。pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-126体外转染内皮祖细胞,用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测转染后的内皮祖细胞中miR-126的表达。然后结扎大鼠肾下段下腔静脉建立深静脉血栓模型,将慢病毒转染的内皮祖细胞移植到静脉血栓模型中。分为三组:A组(12只),空白对照组,经尾静脉注射1ml PBS;B组(12只),EPCs/pLVX-IRES-ZsGreenVector (EPCs/vector),经尾静脉注入含有1.0×106EPCs/vector的PBS细胞悬液。C组(12只),EPCs/pLVX-IRES-ZsGreen-miR-126(EPCs/miR-126),经尾静脉注入含有1.0×106EPCs/miR-126的PBS细胞悬液。移植后7天、14天取出血栓段下腔静脉及血栓,通过称重评价血栓溶解情况,荧光示踪观察内皮祖细胞归巢到静脉血栓情况,HE染色评价静脉血栓机化及CD34免疫组化观察血栓再通变化。采用SPSS15.0软件进行分析,P<0.05为差异,有统计学意义。结果:成功培养、鉴定了大鼠骨髓源性内皮祖细胞。电转成功后,miR-126对内皮祖细胞早期具有促进增殖及改变细胞周期的作用,后期没有影响。划痕实验及穿膜实验都证实了miR-126模拟物能够显著促进内皮祖细胞的迁移运动能力;miR-126抑制剂则能抑制内皮祖细胞的迁移运动能力。miR-126模拟物可以增强内皮祖细胞的成小管能力,miR-126抑制剂能抑制内皮祖细胞的成小管能力。野生型PIK3R23’UTR和突变体PIK3R23’UTR的Luciferase报告基因载体构建及鉴定成功,共转染miR-126模拟物和pMIR/PIK3R2报告基因载体后,萤光素酶活性明显降低,而共转染miR-126抑制剂和pMIR/PIK3R2报告基因载体后,萤光素酶活性变化不大,共转染miR-126模拟物或抑制剂和pMIR/PIK3R2/mut报告基因载体后则不影响信号强度。上调内皮祖细胞中miR-126表达水平后,其PIK3R2蛋白表达水平明显下降,PI3K和磷酸化的Akt(p-Akt)蛋白表达上调,而下调内皮祖细胞中miR-126表达水平后,其PIK3R2蛋白表达水平明显增加,PI3K和磷酸化的Akt(p-Akt)蛋白表达下调。经酶切及测序结果提示慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-126构建正确,能有效转染内皮祖细胞,转染miR-126后在内皮祖细胞的表达较对照组高216倍。内皮祖细胞被移植到静脉血栓后,在7天和14天两个时间段内,EPCs/miR-126组中静脉血栓的重量最低,萤光阳性细胞数目最多,HE染色和CD34免疫组化提示更能促进血栓的机化和再通,均有统计学意义。结论: miR-126能够促进内皮祖细胞成血管能力,包括增殖、迁移和成小管能力,miR-126能够负性调控其靶基因PIK3R2,激活PI3K/AKT信号通路。上调内皮祖细胞的miR-126表达后能够促进静脉血栓溶解、机化和再通。这可能是内皮祖细胞介导的治疗深静脉血栓的一种新思路。