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目的:肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率排在世界第五位,是世界第三高死亡率的肿瘤。目前有多种HCC治疗方案,但是全球HCC患者5年生存率仍然低于5%,其主要原因是手术切除术、化学疗法通常会有严重的副作用。因此,迫切需要寻找和研究出一种安全有效的新药物或药物传递系统来改善以上的弊端,从而到达预防和治疗HCC的目的。国内外研究报道狼毒、京大戟、蒲公英等中药对多种肿瘤模型具有显著抑制作用,而越来越多的研究表明中药中的单体成分（雷公藤红素、斑蝥素）对肿瘤性疾病具有一定的治疗作用。羽扇豆醇是狼毒、京大戟、蒲公英等中药中的主要化学成分,大量研究证实羽扇豆醇在多种肿瘤细胞系和癌症模型中发挥了显著的抗肿瘤作用。但是,由于羽扇豆醇存在不溶于水,生物利用度低等缺点,从而限制了其开发使用。因此,需要一种新型药物载体改善其作用性质以及它的靶向性。本课题首先构建一个具有肝靶向性长循环能力的羽扇豆醇脂质体,然后作用于HepG2细胞研究该制剂的靶向性以及肿瘤相关的蛋白信号通路,最后利用SB（睡美人转座子）介导的高压尾静脉注射转染AKT/c-Met诱导的小鼠HCC模型作为实验动物模型,进一步验证最佳剂量下的羽扇豆醇肝靶向长循环脂质体的抗肿瘤能力、靶向能力及其分子机制。本课题为羽扇豆醇给药系统研究提供新思路,同时为基因转染建立的小鼠原位肝细胞癌模型应用于靶向给药体内药效学评价提供新的依据。方法:1.采用HPLC建立羽扇豆醇含量测定的方法;采用超滤离心法、过膜法以及鱼精蛋白沉淀法进行筛选适合羽扇扇豆醇脂质体包封率测定的方法;以包封率为评价指标,考察适合脂溶性药物的脂质体制备方法;采用单因素试验法筛选影响羽扇豆醇普通脂质体的因素,为后续羽扇豆醇肝靶向脂质体的制备工艺提供参考。2.以包封率和粒径为评价指标,采用正交试验法,考察主要影响因素对羽扇豆醇肝靶向脂质体制备工艺的影响,优选最佳制备工艺;考察不同的冻干保护剂对羽扇豆醇脂质体包封率和粒径的影响,优选最佳冻干保护剂;采用TEM、SEM观察脂质体的形态,动态光散射法测粒径、PDI、ZETA电位;采用透析的方法考察游离羽扇豆醇、羽扇豆醇脂质体、羽扇豆醇肝靶向脂质体的体外释放行为,并对体外释放进行模拟方程拟合;以包封率和粒径为评价指标,考察游离羽扇豆醇、羽扇豆醇脂质体、羽扇豆醇肝靶向脂质体的稀释稳定性、长期稳定性以及血浆稳定性。3.体外靶向性研究中,采用流式细胞仪检测相同剂量不同剂型的羽扇豆醇制剂对HepG2细胞摄取效果来进行定性研究;采用HPLC检测相同剂量不同剂型的羽扇豆醇制剂在HepG2细胞中的摄取量来进行定量研究;体内靶向性研究,采用活体成像仪进行检测相同剂量不同剂型的制剂在FVB小鼠体内各脏器的分布情况。4.采用HPLC对相同剂量不同剂型的羽扇豆醇制剂在SD大鼠中不同时间点的血药浓度进行检测,平均血药浓度-时间数据用DAS3.0软件以非房室模型进行统计矩拟合分析。5.体外药效学评价中,采用CCK8法测定相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对HepG2细胞生存率的影响;采用流式细胞仪检测相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对细胞凋亡、周期的影响;采用Western blot检测相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对HepG2细胞AKT/mTOR和Ras/MAPK信号通路相关蛋白表达的影响。6.采用高压尾静脉转染技术,在FVB/N小鼠肝脏内同时过表达AKT（带有HA-Tag）和c-Met（带有V5-Tag）进行肝细胞癌模型造模,研究相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对AKT/c-Met诱导的小鼠肝脏外观、肝脏重量、病理学组织的影响;采用qPCR检测相同剂量不同剂型羽扇豆醇制剂对AKT/c-Met诱导的HCC小鼠肝癌标志物的影响;采用Western blot检测相同剂量的不同剂型羽扇豆醇制剂对AKT/c-Met诱导的小鼠AKT/mTOR和Ras/MAPK信号通路相关蛋白的表达的影响。结果:1.建立了羽扇豆醇的HPLC含量测定方法;羽扇豆醇在氯仿中的溶解度最高,在水中不溶;最终确定过膜法为羽扇豆醇脂质体包封率的测定方法,薄膜分散法为羽扇豆醇脂质体的制备方法;通过单因素试验法确定了影响羽扇豆醇脂质体制备工艺最大的因素是药脂比、磷胆比、PEG2000-DSPE。2.通过正交试验工艺考察,包封率为考察指标,最终确定羽扇豆醇肝靶向脂质体最佳制备工艺为磷胆比7:1,药脂比1:10,Gal-PEG-DSPE在处方中的质量百分比为10%;以包封率和粒径为评价指标,选择蔗糖为冻干保护剂时所有比例粒径和包封率均在合格范围内,且在15%的质量百分比的时候包封率最高,最终确定加入处方质量比15%的蔗糖为冻干保护剂;释放度考察中游离羽扇豆醇（Free Lupeol）在10h内释放了接近70%,而羽扇豆醇脂质体（Lupeol-L）、羽扇豆醇肝靶向脂质体（Gal-Lupeol-L）在10 h内只释放了大约40%,动力学拟合后发现Free Lupeol的释放符合一级动力学方程,Lupeol-L、Gal-Lupeol-L的释放符合Weibull方程;稀释稳定性考察结果表明羽扇豆醇脂质体在稀释20倍的条件下比较稳定,长期稳定性考察结果表明羽扇豆醇冻干脂质体在4℃冰箱存放6个月是稳定的,溶血性考察结果表明Free Lupeol有轻微溶血,而Lupeol-L、Gal-Lupeol-L不溶血。3.体外靶向定性研究结果表明靶向组的摄取强度要高于游离药物组和非靶向药物组,定量研究结果表明Gal-Lupeol-L是游离Lupeol摄取量的1.65倍,是Lupeol-L摄取量的1.17倍（P<0.05）;体内靶向性研究结果表明Gal-NR-L组在小鼠肝脏部位的荧光一直持续到24h,而游离NR和NR-L组的小鼠在肝脏部位的荧光5 h时基本消失。4.药动学研究结果表明羽扇豆醇靶向组的药时曲线下面积约为游离药物组的3倍;羽扇豆醇靶向组的平均滞留时间MRT和血浆半衰期T1/2分别约为游离药物组的2.36倍和3.21倍。5.Free Lupeol、Lupeol-L、Gal-Lupeol-L作用于HepG2细胞24 h、48 h的IC50值分别为163μM、126μM、87μM,122μM、82μM、61μM;Free Lupeol、Lupeol-L、Gal-Lupeol-L的凋亡率分别为4.3%、8.73%、18.51%,Gal-Lupeol-L可以阻滞HepG2细胞于G2/M期;与Free Lupeol组相比,Gal-Lupeol-L组处理后的HepG2细胞AKT/mTOR相关蛋白（p-AKT308、p-AKT473、p-RPS6、FASN）、Ras/MAPK通路下游的主要效应分子p-ERK1/2表达以及肿瘤增殖标志物PCNA表达也都显著降低。6.成功制备了高压尾静脉转染AKT、c-Met质粒共表达的肝细胞癌模型,Gal-Lupeol-L给药组小鼠的肝脏指数和肝脏重量较游离组明显减轻（P<0.05）;Gal-Lupeol-L组相较Free Lupeol组的小鼠肝脏肝小叶结构更为清晰,空泡减轻的更为明显,胞浆更加丰富;与Free Lupeol和Lupeol-L组相比,Gal-Lupeol-L给药后的小鼠肝脏AFP、GPC3、Epcam的mRNA表达水平降低的更为明显（P<0.01）;与Free Lupeol处理组相比,Gal-Lupeol-L组处理后的AKT/c-MET诱导的HCC小鼠的AKT/mTOR相关蛋白（p-AKT308、p-AKT473、p-RPS6、FASN）、Ras/MAPK通路下游的主要效应分子p-ERK1/2表达以及肿瘤增殖标志物PCNA表达降低的更为明显。结论:成功的制备了包封率高、粒径小于200 nm的肝靶向羽扇豆醇脂质体;相较于游离羽扇豆醇和非靶向羽扇豆醇脂质体,它在体外和体内都具有更好的靶向性;在药动学方面,羽扇豆醇肝靶向脂质体在体内的平均滞留时间MRT和血浆半衰期T1/2都要优于游离羽扇豆醇;羽扇豆醇肝靶向脂质体在体外对HepG2细胞显示出比较好的细胞毒性、凋亡效率,对AKT/c-Met通路相关蛋白表达降低的效果更好;羽扇豆醇肝靶向脂质体对AKT/c-Met诱导的HCC小鼠具有一定的抗肿瘤作用并且相关通路抑制作用相较于游离羽扇豆醇和非靶向羽扇豆醇脂质体更好。