【摘 要】
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自然界中广泛存在的黄曲霉毒素B1（AFB1）由于潜在的致癌性威胁着人类以及动物的健康。酶法降解作为一种有效且环保的方法逐渐被人们应用。但是目前发现的大多数是野生酶,由于野生酶的不稳定性难以被广泛的应用和开发。所以本研究克隆了来自云芝（Trametes versicolor）中的黄曲霉毒素降解酶基因（TV-AFB1D）,成功构建p ET-28a（+）-TV-AFB1D原核表达载体以及p PIC9K-
【基金项目】
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安徽省自然科学基金（1908085MC80）,云芝黄曲霉毒素解毒酶的酵母基因工程菌构建及解毒机制研究； 中央高校基础研究基金（资助号:PA2020GDSK0058）； 安徽省科技重大项目（202003c08020001）；
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自然界中广泛存在的黄曲霉毒素B1（AFB1）由于潜在的致癌性威胁着人类以及动物的健康。酶法降解作为一种有效且环保的方法逐渐被人们应用。但是目前发现的大多数是野生酶,由于野生酶的不稳定性难以被广泛的应用和开发。所以本研究克隆了来自云芝（Trametes versicolor）中的黄曲霉毒素降解酶基因（TV-AFB1D）,成功构建p ET-28a（+）-TV-AFB1D原核表达载体以及p PIC9K-His-TV-AFB1D真核表达载体。研究了TV-AFB1D的酶学特性和降解AFB1的效果,研究了TV-AFB1D在AFB1污染的花生中的应用,本研究为进一步探索TV-AFB1D在AFB1降解中应用提供了依据,主要结论如下:（1）TV-AFB1D基因的克隆和信息学分析。从云芝中通过反转录PCR扩增得到了TV-AFB1D基因,构建重组克隆载体p EASY-TV-AFB1D,转入E.coli DH5α,测序验证序列正确并进行分析。TV-AFB1D与Trametes versicolor FP-101664 SS1（序列号:txid717944）同源性99.76%。蛋白质进化树表明,TV-AFB1D与Trametes pubescens的黄曲霉毒素降解酶有最高的同源性。目的蛋白由696个氨基酸构成,分子式为C3478H5422N916O1052S7,相对分子质量为33572.34,是亲水性蛋白,其中不含有信号肽。TV-AFB1D有45.26%的α-螺旋,12.93%的β-折叠,41.81%的无规则卷曲,并且TV-AFB1D中没有非常规的二级结构。（2）TV-AFB1D表达优化和酶学特性的研究。构建表达载体p ET-28a（+）-TV-AFB1D,并成功导入E.coli BL21（DE3）进行表达。重组大肠杆菌中最优诱导条件为:4 h和0.8 mmol·L-1 IPTG。经过Ni2+纯化和SDS-PAGE表明,蛋白质大小为77 k Da。酶学特性研究表明,TV-AFB1D的最适p H和最适温度分别是7和32℃,在p H 6-8和30-34℃内其残余酶活力最好,稳定性最高。酶动力学参数:y=0.01671x+1.80756(R~2=0.994,Km=9.24 mmol·L-1,Vmax=553.23 m M·min-1)。反应初始的催化速度和反应温度的关系为:lnv=16.51-3338.73/T（R~2=0.999）。圆二色谱研究表明,无规则卷曲、α-螺旋和反平行结构的百分比可能是影响TV-AFB1D活性和稳定性的主要因素。（3）TV-AFB1D催化AFB1的研究。HPLC表明了催化后,有特异性产物的生成,催化时间5 h降解67.4%的AFB1。分子对接模型表明,TV-AFB1D与AFB1之间存在着氢键作用力。LC-TOF-MS表明了有新的产物生成,通过推测产物的分子式有可能是C12H12O2或C13H12O4。（4）重组毕赤酵母（P.pastoris）GS115的构建和在AFB1污染花生中的初步应用。通过双酶切连接构建p PIC9K-His-TV-AFB1D表达载体。通过电穿孔法转化入P.pastoris GS115中,构建出表型为His+Mut+的P.pastoris。诱导84 h后,经过Ni2+纯化和SDS-PAGE表明出现77 k Da的特异性蛋白条带,酶活达到17.5 U/m L。诱导时间84 h时,温度为28℃和0.8%的甲醇浓度下,重组P.pastoris GS115表达的TV-AFB1D诱导条件最优。TV-AFB1D催化12 h,降解率达到75.9%。对于AFB1污染的花生中,催化18 h后,降解率达到48.5%。通过温度探究,发现在34℃下对污染的花生中的AFB1降解效果最好。
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