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目的: 研究雌激素膜受体G蛋白偶联受体30(G protein—coupled receptor30,GPR30)对黑素合成的影响及其可能的机制。 方法: 1.应用半定量RT-PCR和Western Blot的方法测定GPR30在人A375细胞中的表达。 2.选取不同浓度的GPR30激动剂G-1及不同强度UVA作用于A375细胞,雌二醇处理作为阳性对照。MTT法测定作用后A375细胞细胞增殖的变化,选取最佳药物浓度段和照光强度;并在最佳照光强度下,选取不同浓度GPR30拮抗剂G-15作用于A375细胞,MTT法选取最佳G-15药物最佳浓度段。 3.根据MTT结果,在G-1药物最佳浓度段内选取0.2μM,0.4μM,0.8μM三个浓度,雌二醇处理作为阳性对照; NaOH溶解法检测其作用24h后黑素合成量,同时分别检测G-1处理后24h,48h,72h黑素合成量变化,检测其酪氨酸酶活性;同时应用WesternbBlot的方法测定酪氨酸酶及小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia-associatedtranscript-Ion factor, MITF)在蛋白水平表达。 4.根据MTT结果,在照光后G-15药物最佳浓度段内选取0.2μM,0.4μM,0.8μM三个浓度。NaOH溶解法检测其作用24h后黑素合成作用,检测其酪氨酸酶活性;同时应用Western Blot的方法测定酪氨酸酶及MITF蛋白水平表达。 5.使用ShGPR30质粒转染A375细胞,抑制细胞内GPR30表达,NaOH溶解法检测其UVA照射后黑素合成量改变,并检测其酪氨酸酶活性;同时应用Western Blot的方法测定其UVA照射前后酪氨酸酶及MITF蛋白水平表达改变。 6.构建过表达GPR30的A375细胞模型,NaOH溶解法检测其黑素合成量,检测其酪氨酸酶活性;同时应用Western Blot的方法测定酪氨酸酶及MITF在蛋白水平表达。 结果: 1.GPR30在mRNA水平及蛋白水平均在人A375细胞中有明显表达。 2.G-1在10-3μM到1μM浓度促进人黑素瘤细胞的增殖(p≤0.05),最终选取0.2μM,0.4μM,0.8μM三个浓度点。5 J/cm2到60 J/cm2强度内的UVA照射后,能促进黑素瘤细胞的增殖(p≤.05),而这一作用在30 J/cm2时最明显,最终选取UVA30J/cm2处理A375细胞,在这一强度下,G-15在10-3μM到1.5μM浓度下抑制人黑素瘤细胞的增殖,最终选取0.2μM,0.4μM,0.8μM三个浓度点。 3.不同浓度浓度G-1(0.2μM,0.4μM,0.8μM)处理A375细胞24小时后,黑素合成及酪氨酸酶活性检测结果显示,GPR30激动剂G1对黑素合成及酪氨酸酶活性有促进作用,并存在一定浓度依赖趋势。而在24h,48h和72h三个时间点,0.8μM G-1对黑素合成的影响无明显统计学差异(p>0.05),无明显时间依赖趋势。Western Blot结果显示G-1能促进酪氨酸酶及MITF在蛋白水平表达,并且这种促进作用呈浓度依赖趋势。 4.在30J/cm2 UVA照射后,不同浓度浓度G15(0.2μM,0.4μM,0.8μM)处理A375细胞24小时,黑素合成及酪氨酸酶活性检测结果显示,照光对人A375细胞黑素合成及酪氨酸酶活性有明显促进作用,而GPR30拮抗剂G15能抑制照光后的促进黑素合成作用,并存在一定浓度依赖趋势。Western Blot结果显示照光能促进酪氨酸酶及MITF在蛋白水平表达,而G-15处理后能呈浓度依赖趋势的抑制这种促进作用。 5.抑制GPR30表达的A375细胞,予UVA照射后,黑素合成及酪氨酸酶活性检测结果显示抑制GPR30表达的A375细胞其黑素合成及酪氨酸酶活性低于空载照光组A375细胞,Western Blot检测结果证实,抑制组内照光后酪氨酸酶及MITF在蛋白水平表达均较空载照光组细胞低。 6过表达GPR30的A375细胞,其黑素合成能力及酪氨酸酶活性检测均高于空载组A375细胞,Western Blot检测结果证实,转染ShGPR30的细胞内酪氨酸酶及MITF在蛋白水平表达均较正常细胞高。 结论: 1.G蛋白偶联受体30(GPR30)在人黑素瘤A375细胞中表达,并在其黑素合成中发挥重要作用。 2.GPR30促进人A375细胞黑素合的作用与其上调酪氨酸酶活性及表达、MITF表达有关。