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研究背景:泡型包虫病（Alveolar Echinococcosis,AE）是由多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis,E.multilocularis）中绦期幼虫-泡球蚴,感染引起的一种人畜共患寄生虫病,在肝脏中呈现类肿瘤样浸润生长,故又称之为“虫癌”。泡球蚴在宿主体内诱导的Th1免疫应答利于机体抗虫,然而在AE慢性期免疫应答呈Th2/Treg（Regulatory T cell,Treg）优势,这成为机体抗虫的重要障碍。近年来,AE的发病率在我国不断上升,而目前获批的临床药物主要有阿苯达唑和甲苯达唑,但长期使用导致的虫体耐药现象日益增多,且毒副作用明显。因此,急需研发新药。砂生槐（Sophora moorcroftiana,S.moorcroftiana）为青藏高原特有植物,性苦、寒,可治疗白喉、虫病、消化不良等疾病。本实验室前期研究结果表明砂生槐种子亲脂性总生物碱在体外可杀灭细粒棘球蚴原头节,灌胃治疗原头节感染的小鼠可抑制体内棘球蚴生长,提示该生物碱中含有驱虫成分。但由于亲脂性总生物碱水溶性较差,抗虫效果不明显,因此本实验室前期利用热回流法提取砂生槐种子水溶性生物碱并筛选到有效抗虫成分E2-a。本文在此基础上研究E2-a体外抗泡球蚴和下调Treg效应及机制。研究方法:在无菌条件下取出昆明种小鼠腹腔中长期保种的泡球蚴包囊组织块,以肝癌细胞（Hep G2）作为饲养细胞进行培养,建立泡球蚴体外生长体系,培养2个月后得到大量囊泡。24孔细胞培养板内每孔接种10个囊泡,加入不同浓度E2-a,每日使用体视显微镜观察各组囊泡大体的形态变化,5天后收集囊泡进行以下实验:常规H＆E染色后普通光学显微镜下观察囊泡生发层细胞形态变化;扫描电镜（SEM）观察囊泡超微结构变化;收集囊泡培养上清液检测碱性磷酸酶（ALP）活性;将E2-a处理5天后的囊泡接种至BALB/c小鼠腹腔,常规饲养小鼠,分别于17周和25周观察囊泡生长情况;提取囊泡总RNA,RT-PCR检测囊泡生发层细胞emras、emmpk1和emsmad D m RNA水平变化。收集200个已培养12个月的囊泡,在无饲养细胞条件下培养5天。培养结束后,收集培养上清即为泡球蚴分泌排泄产物（Excretory/secretory products,ES）,并抽取囊泡内囊液（Vesicle Fluid,VF）,置于-80℃保存备用。分离BALB/c小鼠脾细胞（Spleen cells,SP）,添加CD3单抗、CD28单抗、IL-2和TGF-β建立小鼠脾细胞生成Treg细胞体系,设置SP组:仅脾细胞;SP+STIM（Stimulation,STIM）组:脾细胞+CD3单抗+CD28单抗+IL-2+TGF-β;SP+STIM（TGF-βnegative）组:脾细胞+CD3单抗+CD28单抗+IL-2,在SP+STIM（TGF-βnegative）组的基础上分别加入不同浓度的ES和VF,通过流式细胞术检测各组脾细胞分化为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的情况,筛选出在脾细胞分化为Treg细胞过程中的ES和VF最佳干预浓度。根据上述实验结果,得到ES和VF的最佳浓度后,在SP+STIM组的基础上分别加入ES、VF、E2-a、以及ES+E2-a、VF+E2-a,通过流式细胞术检测各组脾细胞分化为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的情况,评价在ES或VF刺激条件下E2-a对小鼠脾细胞分化为CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的影响。根据以上流式细胞术的结果,Western Blot检测100μg/m L ES刺激条件下E2-a对小鼠脾细胞p-Smad2、p-STAT3和p-m TOR蛋白表达的影响,以及ELISA检测培养上清IL-10水平。研究结果:1.砂生槐种子水溶性生物碱E2-a体外抗泡球蚴效应及机制,囊泡在体外经E2-a作用后:（1）体视显微镜观察结果显示,Untreated组培养基清澈,囊泡在培养过程中均无皱缩及破裂。1 mg/m L E2-a组培养基较Untreated组稍浑浊,大部分囊泡轻微皱缩;2 mg/m L E2-a组培养基较浑浊,囊泡皱缩较为严重;4 mg/m L E2-a组培养基浑浊,囊泡全部严重皱缩,部分囊泡破裂释放内容物。镜下观察H＆E染色切片结果显示,Untreated组囊泡生发层细胞紧贴角皮层,排列整齐,细胞核清晰可见;E2-a（4 mg/m L）组大部分生发层已经脱离角皮层,生发层细胞数量明显减少,排列疏松凌乱,且细胞核脱离胞质,裸露在外,角皮层与Untreated组相比明显变薄。SEM观察囊泡超微结构显示,Untreated组可见生发层细胞完整光滑,生长状态良好,未见细胞缺失及皱缩;E2-a（4 mg/m L）组可见生发层细胞皱缩,排列不规则,部分生发层细胞缺失。（2）囊泡培养上清液中ALP活性检测显示,与Untreated组比较,1 mg/m L E2-a组、2 mg/m L E2-a组和4 mg/m L E2-a组ALP活性无明显差异（P＞0.05）。（3）囊泡活力检测结果显示,第17周剖杀小鼠时可见Untreated组小鼠肝脏和肠道出现大量囊泡,E2-a（4 mg/m L）组囊泡主要分布于肠道,与Untreated组总囊泡个数（11.2±3.7）相比,E2-a组总囊泡个数（4.4±2.0）显著低于Untreated组（P＜0.01）;第25周剖杀小鼠时可见,与Untreated组总囊泡个数（8.0±2.67）相比,E2-a组总囊泡个数（10.2±1.7）无明显差异（P＞0.05）。（4）RT-PCR检测囊泡生发层细胞emras、emmpk1和emsmad D m RNA表达水平,结果显示,与Untreated组比较,1 mg/m L E2-a组、2 mg/m L E2-a组和4 mg/m L E2-a组的m RNA表达水平无明显变化（P＞0.05）。2.砂生槐种子水溶性生物碱E2-a体外下调Treg效应及分子机制:（1）流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例,结果显示,（1）与SP+STIM（TGF-βnegative）组相比,SP+STIM（TGF-βnegative）+100μg/m L ES组和SP+STIM（TGF-βnegative）+100μg/m L VF组的Treg细胞比例显著降低（P＜0.001）。（2）与SP+STIM组比,SP+STIM+ES组和SP+STIM+VF组两组的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例均明显下降（P＜0.05）;与SP+STIM+ES组相比,SP+STIM+ES+E2-a组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例降低（P＜0.05）;与SP+STIM+VF组相比,SP+STIM+VF+E2-a组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例无明显差异（P＞0.05）。（2）在100μg/m L ES刺激条件下,E2-a作用于小鼠脾细胞后,Western Blot检测p-Smad2、p-STAT3和p-m TOR蛋白的表达水平,结果显示,与SP+STIM组相比,SP+STIM+ES+E2-a组的p-Smad2（P＜0.001）、p-STAT3（P＜0.001）和p-m TOR（P＜0.05）蛋白表达水平均降低;ELISA检测细胞培养上清IL-10水平,结果显示,与SP+STIM组相比,SP+STIM+ES+E2-a组的IL-10水平显著降低（P＜0.001）。研究结论:1.砂生槐种子水溶性生物碱E2-a体外具有明显的损伤泡球蚴效应,但未能下调囊泡生发层细胞Ras Raf-MEK-ERK MAP激酶级联信号通路相关分子emras、emmpk1和TGF-β/BMP-Smad信号通路相关分子emsmad D。2.砂生槐种子水溶性生物碱E2-a作用于100μg/m L ES刺激条件下的小鼠脾细胞,可显著抑制Treg细胞的生成,其机制可能与下调p-Smad2、p-STAT3和p-m TOR蛋白的表达水平有关。