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慢性肾脏病主要表现为肾小球滤过率下降和/或尿蛋白排泄增加,呈不可逆性、进行性进展。蛋白尿是慢性肾脏病进展的重要标志以及危险因素,足细胞包裹在肾小球滤过屏障毛细血管周围,足细胞足突的融合或消失是出现蛋白尿的重要原因。足细胞显示出较高的基础自噬水平,自噬失调参与多种肾脏疾病进程。前期研究表明,加味黄芪赤风汤能够减少阿霉素肾病大鼠尿蛋白,减少足细胞内自噬小体,下调LC3以及beclin-1的表达,抑制肾脏过度自噬。自噬负调控信号通路PI3K/AKT/mTOR以及自噬正调控信号通路AMPK/mTOR对自噬的双向调控作用,与中医阴阳平衡、阴阳互根理论有一定的契合之处。基于这种认识,本研究通过体内、外实验相结合,进一步探讨加味黄芪赤风汤调控自噬对肾脏的保护作用机制。实验一加味黄芪赤风汤通过PI3K/AKT/mTOR及AMPK/mTOR通路调控自噬缓解阿霉素肾病大鼠肾脏损伤目的:观察加味黄芪赤风汤对阿霉素肾病大鼠的肾脏保护作用,基于PI3K/AKT/mTOR以及AMPK/mTOR信号通路,探讨加味黄芪赤风汤的自噬调控机制。方法:SD大鼠单次尾静脉注射阿霉素（5 mg/kg）建立蛋白尿肾病模型。分为空白组、模型组、加味黄芪赤风汤组、3MA组、3MA+加味黄芪赤风汤组以及替米沙坦组,连续给药6周。分别于药物干预前以及干预后的第2、4、6周末检测24h尿蛋白定量。于给药后第6周末取材,测定血清生化指标,HE、Masson、PAS染色观察肾脏病理损伤,透射电镜观察肾脏超微结构改变,免疫组化分析肾脏纤维化指标FN、LN、Col Ⅳ在肾组织的表达,Western blot以及免疫荧光检测自噬相关蛋白及通路蛋白的表达。结果:（1）24h尿蛋白定量及生化指标:单次尾静脉注射阿霉素10天后,与空白组相比,造模大鼠24 h尿蛋白定量显著增多（P＜0.01）。给药干预后的第2周末,加味黄芪赤风汤组、3MA组、3MA+加味黄芪赤风汤组以及替米沙坦组24h尿蛋白定量有下降趋势,但与模型组相比无统计学差异。第4周末,加味黄芪赤风汤组、3MA+加味黄芪赤风汤组以及替米沙坦组24 h尿蛋白定量显著下降,与模型组相比存在统计学差异（P＜0.05）。第6周末,与模型组相比,加味黄芪赤风汤组、3MA组、3MA+加味黄芪赤风汤组以及替米沙坦组24 h尿蛋白定量均显著下降（P＜0.05）。加味黄芪赤风汤组、3MA组、3MA+加味黄芪赤风汤组以及替米沙坦组进行组间比较无统计学差异（P＞0.05）。经药物干预6周后,检测血生化相关指标。与空白组相比,模型组尿素以及血肌酐升高（P＜0.01）;与模型组相比,加味黄芪赤风汤能够降低尿素以及血肌酐（P＜0.05）,3MA能够降低尿素（P＜0.05）,但是对血肌酐无显著影响（P＞0.05）,加味黄芪赤风汤组、3MA组、3MA+加味黄芪赤风汤组的Urea以及Scr行组间比较,无统计学差异（P＞0.05）;替米沙坦对尿素以及血肌酐均无显著影响（P＞0.05）。与空白组相比,模型组白蛋白降低（P＜0.01）;与模型组相比,加味黄芪赤风汤、3MA以及替米沙坦对白蛋白无显著影响（P＞0.05）。与空白组相比,模型组甘油三酯以及胆固醇升高（P＜0.01）;与模型组相比,3MA能够降低甘油三酯（P＜0.05）,加味黄芪赤风汤以及替米沙坦对甘油三酯以及胆固醇无显著影响（P＞0.05）。（2）改善肾脏病理损伤:各组大鼠肾组织经HE、Masson、PAS染色后,光镜下观察肾脏病理改变。空白组大鼠肾组织可见肾小球结构完整,血管腔清晰,球囊比例正常,肾小球内未见明显系膜细胞增多以及系膜基质沉积;肾小管排列规则,小管上皮细胞正常。模型组肾小球出现代偿性扩张或萎缩,系膜细胞增生,系膜基质沉积,胶原纤维增多;肾小管排列紊乱,囊性扩张或萎缩,小管上皮细胞肿胀、变性。加味黄芪赤风汤组、3MA组、3MA+加味黄芪赤风汤组以及替米沙坦组的肾小球以及肾小管病变均不同程度减轻。透射电镜结果显示,加味黄芪赤风汤、3MA以及替米沙坦能够缓解阿霉素诱导的足细胞足突融合。免疫组化结果显示,加味黄芪赤风汤、3MA以及替米沙坦能够下调肾脏纤维化指标FN、LN、Col Ⅳ的表达。（3）调节肾脏自噬:Western blot检测各组大鼠肾组织中LC3、beclin-1、p62的表达。与空白组相比,模型组大鼠肾组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1、p62表达上调（P＜0.01）,加味黄芪赤风汤组、3MA组、3MA+加味黄芪赤风汤组以及替米沙坦组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1、p62表达下调（P＜0.05）。LC3免疫荧光结果与Western blot结果一致,模型组大鼠肾小球LC3荧光表达增多,加味黄芪赤风汤组、3MA组、3MA+加味黄芪赤风汤组以及替米沙坦组LC3荧光表达减少。（4）调控P13K/AKT/mTOR及AMPK/mTOR自噬通路:Western blot检测各组大鼠肾组织中的p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR的表达。结果显示,模型组p-PI3K/PI3K、p-AKT、AKT以及p-mTOR/mTOR表达下调（P＜0.01）,p-AMPK/AMPK表达上调（P＜0.01）。与模型组相比,加味黄芪赤风汤能够上调p-PI3K/PI3K、p-AKT、AKT以及p-mTOR/mTOR的表达（P＜0.05）,下调p-AMPK/AMPK的表达（P＜0.01）;3MA+加味黄芪赤风汤以及替米沙坦能够上调p-PI3K/PI3K、p-mTOR/mTOR的表达（P＜0.01）,下调p-AMPK/AMPK的表达（P＜0.05）。阿霉素肾病大鼠肾脏PI3K/AKT/mTOR信号通路受抑,同时AMPK/mTOR信号通路激活,而加味黄芪赤风汤能够拮抗该作用。结论:（1）加味黄芪赤风汤能够减少阿霉素肾病大鼠尿蛋白,改善肾脏病理损伤。（2）3MA能够减少阿霉素肾病大鼠尿蛋白,改善肾脏病理损伤,表明过度自噬是导致肾脏损伤的重要机制;加味黄芪赤风汤与3MA共用未能进一步减少尿蛋白以及改善肾脏病理损伤,表明抑制过度自噬是加味黄芪赤风汤的主要作用机制。（3）加味黄芪赤风汤通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,同时抑制AMPK/mTOR信号通路,抑制过度自噬,发挥肾脏保护作用。实验二加味黄芪赤风汤调控PI3K/AKT/mTOR及AMPK/mTOR自噬通路交互作用保护足细胞目的:通过培养体外足细胞,观察加味黄芪赤风汤的足细胞保护作用,基于PI3K/AKT/mTOR以及AMPK/mTOR信号通路,探讨加味黄芪赤风汤的自噬调控机制。方法:体外培养足细胞,建立阿霉素足细胞损伤模型,采用CCK-8法检测足细胞的活性,筛选合适的造模浓度以及时间。制备加味黄芪赤风汤含药血清。足细胞分为空白组、模型组、加味黄芪赤风汤低剂量组、加味黄芪赤风汤中剂量组、加味黄芪赤风汤高剂量组、3MA组以及雷帕霉素组。采用CCK-8法检测足细胞活性,Western blot检测足细胞损伤相关蛋白nephrin、podocin的表达,以及自噬相关蛋白LC3、beclin-1、p62、mTOR的表达,透射电镜观察足细胞内自噬小体,溶酶体荧光探针评价自噬流水平。经Pik3r1 siRNA以及Prkaa1/Prkaa2过表达质粒干预后,Western blot检测PI3K、AKT以及AMPK的表达。结果:（1）保护足细胞:采用0.2μg/mL阿霉素,干预24h,建立阿霉素足细胞损伤模型。采用CCK-8法检测足细胞活性,与空白组相比,模型组足细胞活性下降,差异具有统计学意义（P＜0.01）;与模型组相比,加味黄芪赤风汤低、中、高剂量含药血清能够提高足细胞活性（P＜0.01）,3MA也能够提高足细胞活性（P＜0.05）,雷帕霉素与模型组相比无显著差异。Western blot结果显示,与空白组相比,模型组nephrin、podocin表达下调,差异具有统计学意义（P＜0.01）;与模型组相比,加味黄芪赤风汤含药血清以及3MA能够上调nephrin、podocin的表达;雷帕霉素下调nephrin、podocin的表达（P＜0.05）。（2）调节足细胞自噬:Western blot结果显示,与空白组相比,模型组LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ、beclin-1 表达上调（P＜0.01）,p62、p-mTOR/mTOR 表达下调（P＜0.01）;与模型组相比,加味黄芪赤风汤含药血清以及3MA能够下调LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、beclin-1的表达,上调p62、p-mTOR/mTOR的表达;雷帕霉素能够上调LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、beclin-1的表达（P＜0.01）。LC3免疫荧光结果与Western blot结果一致,模型组足细胞LC3表达增多,加味黄芪赤风汤含药血清干预后LC3表达减少。透射电镜观察加味黄芪赤风汤组足细胞内自噬小体的数量减少,溶酶体荧光探针结果显示溶酶体荧光减弱,自噬流的水平下调。（3）调控PI3K/AKT/mTOR及AMPK/mTOR自噬通路交互作用:Western blot结果显示,应用阿霉素干预足细胞后,p-PI3K/PI3K以及p-AKT/AKT表达下降（P＜0.01）,p-AMPK/AMPK表达升高（P＜0.01）;与阿霉素干预组相比,加味黄芪赤风汤能够上调p-PI3K/PI3K以及p-AKT/AKT的表达（P＜0.01）,下调p-AMPK/AMPK的表达（P＜0.01）。通过Pik3r1 siRNA抑制足细胞PI3K的表达,拮抗加味黄芪赤风汤对PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活作用,加味黄芪赤风汤下调p-AMPK/AMPK表达的作用仍然存在（P＜0.01）;通过Prkaa1/Prkaa2过表达质粒提高AMPK的表达,拮抗加味黄芪赤风汤对AMPK/mTOR信号通路的抑制作用,加味黄芪赤风汤上调p-PI3K/PI3K以及p-AKT/AKT表达的作用仍然存在（P＜0.01）。结论:（1）加味黄芪赤风汤能够缓解阿霉素诱导的足细胞损伤。（2）3MA也能够缓解阿霉素诱导的足细胞损伤,而雷帕霉素加重足细胞损伤,说明阿霉素诱导的足细胞自噬为过度自噬;加味黄芪赤风汤能够下调自噬流,抑制阿霉素诱导的过度自噬。（3）加味黄芪赤风汤能够激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,同时抑制AMPK/mTOR信号通路,调控二者维持自噬平衡的交互作用,从而抑制过度自噬,发挥足细胞保护作用。实验三加味黄芪赤风汤成分鉴定目的:对加味黄芪赤风汤的汤剂以及含药血清中的成分进行鉴定,以探讨加味黄芪赤风汤肾脏保护作用以及自噬调节机制的物质基础。方法:制备加味黄芪赤风汤的汤剂以及含药血清,采用超高效液相色谱-串联质谱技术,应用清华大学药学技术中心平台,根据一级质谱图以及二级特征碎片离子进行成分对比分析,鉴定加味黄芪赤风汤中的成分。结果:对加味黄芪赤风汤的汤剂以及含药血清成分进行鉴定,其中加味黄芪赤风汤的汤剂检测出57种成分,含药血清检测出20种成分,推测加味黄芪赤风汤的肾脏保护作用以及自噬调节机制与检测出的成分有关。结论:根据分析结果,并结合文献研究,黄芪成分黄芪甲苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素、黄芪皂苷Ⅱ,赤芍成分芍药苷、丹皮酚,穿山龙成分原薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元、薯蓣皂苷,白花蛇舌草成分车叶草酸,赤芍以及芡实成分没食子酸,以上成分可能是加味黄芪赤风汤肾脏保护作用以及自噬调节机制的物质基础。