前言慢性肺疾病(chronic lung disease, CLD)是患有心肺疾病的新生儿,特别是早产儿,因长时间吸入高浓度氧或机械通气治疗而导致的一种严重的并发症。近年来,新生儿和早产儿管理技术的不断提高,使得低出生体重儿的存活率不断增加,CLD的发病率也呈上升趋势。据报道,出生体重小于750克的病人发生率大于50%,751-1000克病人的发生率为34%,1001-1250克的病人发生率为15%,1251-1500克的发生率为7%。其中,重者生后一年内死于呼吸衰竭,存活者也需长期(数月或数年)依赖氧气或机械通气治疗。CLD的最终结局为不可逆的肺间质纤维化,使患儿肺功能受损,最终严重影响了其生存质量。目前,CLD的发病机制尚不清楚,且仍无理想的防治措施,故探索CLD肺纤维化的发生机制成为当今新生儿领域亟待解决的问题。现研究认为,CLD肺纤维化的发病机理为肺成纤维细胞异常增殖,造成细胞外基质(ECM)合成及降解失衡,而对其发生机制的研究多集中于细胞因子水平。在众多的细胞因子中,因为转化生长因子-β1(transforming growth factor, TGF-β1)与纤维化的关系比较明确,所以其发生作用的机制成为研究的热点。目前有研究发现,调节细胞增殖的最终环节发生在细胞周期水平上。正常细胞周期包括G1、S、G2和M四个时相。期间存在多个调控点调节各时相间的转换,其中较为关键的是G1→S和G2→M这两个调控点,尤以G1→S最为重要。其通过接受细胞周期蛋白构成的网络调节系统作用,发挥细胞周期调控功能。在肾纤维化及肝纤维化领域,均有TGF-β1通过调节相应细胞的细胞周期调控分子(Cyclin、CDK、CDKI)的表达参与细胞增殖,促进纤维化的发生、发展的相关报道。其中,因为细胞周期蛋白依赖性激酶-2(Cyclin-dependent kinases 2, CDK2)及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子-27(Cyclin-dependent kinase inhibitor 27,P27)发挥重要的调控功能而研究较多。那么,在高氧致新生儿CLD肺纤维化发生中,CDK2及P27的作用如何呢?因此,本研究基于我们前期的研究结果,通过应用免疫组化、Real-Time PCR等技术,试图阐明高氧致新生鼠CLD模型中CDK2及P27的表达规律,以及TGF-β1对体外培养新生鼠肺成纤维细胞增殖的影响作用,以期为寻找新的防治途径奠定实验基础。材料与方法一、动物实验(一)实验分组及动物模型的制备将自然分娩的新生鼠,随机分为两组,即实验组(高氧组)和对照组(空气组),每组均为32只。实验组将新生鼠(连同母鼠)生后立即置于氧箱中,持续输入氧气,维持FiO2为0.90,用钠石灰吸收C02,使其浓度小于0.5%,温度为25-27℃,湿度50%-70%,每天定时开箱30 min,添加水、饲料及更换垫料,并与对照组交换母鼠,以避免其因氧中毒致喂养能力下降。对照组置于空气中,具体方法及实验控制因素同高氧组。(二)标本的采集和处理实验3、7、14、21天分别从2组中随机抽取8只,用10%水合氯醛麻醉致死后立即打开胸腔,分离肺组织。将左肺置于4%多聚甲醛中固定,右肺置于-80℃冰箱冻存,用于HE染色、免疫组化及PCR检测。二、体外实验(一)实验动物自然分娩的新生鼠,雌雄不限。(二)肺成纤维细胞的分离及培养将新生鼠用10%水合氯醛麻醉致死,75%酒精中浸泡后,迅速打开胸腔,无菌取出肺组织,分离肺成纤维细胞。将分离成功的肺成纤维细胞进行培养、传代,于第3代细胞进行TGF-β1对肺成纤维细胞的干预实验。(三)TGF-β1刺激实验及取材当传代细胞(第3代)至细胞融合达70%左右,更换为无血清培养液,24小时后进行分组实验。在21%氧浓度条件下,分别用0ng/ml(加入等量的无细胞因子培养液)、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的TGF-β1作用于第3代肺成纤维细胞,于24小时收集细胞。分别按实验方法要求保存标本。用10ng/ml的剂量作用第3代肺成纤维细胞,分别于12、24、48小时进行细胞收集,同时在这三个时间点设立对照组(加入等量的无细胞因子培养液)。分别按实验方法要求保存标本。三、实验方法及指标检测(一)肺组织形态学研究光镜下观察肺组织形态学改变。(二)肺纤维化评分采用Ashcroft等人的方法进行纤维化评分,判断肺纤维化的程度。(三)免疫组织化学技术检测肺组织CDK2及P27蛋白的表达采用SP免疫组织化学技术,于每个时间点随机抽取染色清晰的切片8张,每张切片于光镜下(×400)随机选取5个视野,固定窗口面积,以胞浆和/或胞核中有棕黄色颗粒为阳性细胞,其蛋白的定量测定利用美国Universal Imaging Porpomtion图象分析系统,应用Meta Morph软件分析图像平均灰度值,用来表示CDK2及P27表达的强度,平均灰度值与蛋白表达水平呈反比。(四)实时定量PCR技术检测肺组织CDK2及P27基因表达实时定量PCR技术,先构建目的基因和管家基因的RNA标准品,制作标准曲线,利用标准曲线对样品中的目的基因和管家基因分别进行定量。通过管家基因的校正,检测各组肺组织中CDK2及P27基因的相对表达量。(五)波形蛋白免疫细胞化学技术(成纤维细胞鉴定)收集第3代肺成纤维细胞,用SP及免疫荧光法对成纤维细胞中的波形蛋白进行染色,光镜下观察、鉴定成纤维细胞。(六)Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)检测细胞增殖取第3代肺成纤维细胞调整细胞浓度至5000个/100μL,以每孔100μL接种于96孔板,分别以上述浓度和时间的TGF-β1作用于孔内细胞后每孔加入CCK-810μL,37℃5%CO2孵育箱内继续孵育,1小时后450nm波长处测定吸光度(OD值)。(七)流式细胞仪检测肺成纤维细胞细胞周期的变化取TGF-β1作用后的成纤维细胞,70%乙醇4℃固定,加RNase A于37℃水浴中消化30min。加入PI,放置暗处30 min,流式细胞仪检测细胞周期变化。(八)免疫细胞化学技术检测肺成纤维细胞CDK2及P27蛋白表达采用SP免疫细胞化学技术,每个时间点随机抽取染色清晰的切片4张,每张切片于光镜下(×400)随机选取5个视野,固定窗口面积,以胞浆和/或胞核中有棕黄色颗粒为阳性细胞,其蛋白的定量测定利用美国Universal Imaging Porpomtion图象分析系统,应用Meta Morph软件分析图像平均灰度值,用来表示CDK2及P27表达的强度,平均灰度值与蛋白表达水平呈反比。(九)实时定量PCR技术检测成纤维细胞CDK2及P27基因表达实时定量PCR技术,先构建目的基因和管家基因的RNA标准品,制作标准曲线,利用标准曲线对样品中的目的基因和管家基因分别进行定量。通过管家基因的校正,检测各组细胞中CDK2及P27基因的相对表达量。四、统计学分析数据均以x±S表示,应用SPSS14.0对各组间数据进行分析,两样本方差齐性检验采用F检验,根据样本的方差齐性检验F值,两组间比较分别应用t检验或t’检验,相关性分析采用spearman分析,多组间比较采用方差分析,以P＜0.05表示差异有显著性。结果一、肺组织形态观察生后3天时空气组肺泡间隔变薄,肺泡结构渐规整,大小较均匀,高氧组肺泡间隔有少许炎性细胞渗出,肺泡腔内有少许红细胞渗出；7-21天空气组肺泡间隔变薄,肺泡结构逐渐规整；高氧组7天时,可见肺水肿,间质细胞增多,炎性细胞浸润等；14天时,肺间质成纤维细胞增加,肺泡间隔明显增厚,肺纤维化逐渐形成;21天时,肺泡间隔增宽,肺间质细胞明显增多,肺泡正常结构消失,肺纤维化形成。二、肺组织纤维化评分与对照组相比,14、21天时实验组肺纤维化评分有统计学差异,P＜0.05。三、肺组织CDK2及P27蛋白的表达(一)表达部位空气组CDK2在血管内皮细胞,支气管和细支气管上皮细胞有微弱表达。高氧组3天表达与对照组相似；7天时可见肺上皮细胞、成纤维细胞表达微弱的CDK2；14天时,在肺上皮细胞和间质成纤维细胞中表达均明显增强；21天时,CDK2在这些细胞中的表达进一步增强,肺成纤维细胞为其主要表达细胞。空气组P27在血管内皮细胞,支气管,细支气管上皮细胞和肺成纤维细胞有表达。高氧组3天表达与对照组相似；7天时可见肺上皮细胞、成纤维细胞表达P27减弱;14天时,在肺上皮细胞和间质成纤维细胞中表达均明显减弱；21天时,P27在这些细胞中的表达进一步减弱。(二)表达强度检测实验开始后3、7天实验组和对照组肺组织CDK2及P27表达强度无显著差异(P＞0.05)；随着日龄的增加,实验组CDK2表达逐渐增强,P27表达逐渐减弱,14、21天时与对照组相比,P值均＜0.05。四、肺组织CDK2及P27基因的表达实验开始后3、7天实验组和对照组肺组织CDK2及P27基因表达强度无显著差异(P＞0.05)；14天实验组和对照组CDK2分别为：16.05±6.17和6.94±3.42,P27分别为：33.16±7.61和51.51±8.56(P＜0.05)；21天CDK2分别为：27.06±10.65和8.24±3.60,21天P27分别为：14.82±3.34和41.36±13.05(P＜0.05)。五、相关性分析采用spearman方法进行相关性分析,高氧暴露下新生鼠肺组织CDK2表达与纤维化评分呈明显正相关(r1=0.784,r2=0.702,P<0.05),P27表达与纤维化评分呈明显负相关(r1=-0.819,r2=-0.765,P<0.05)。六、成纤维细胞鉴定倒置显微镜下可见成纤维细胞呈梭形(×100),经免疫组化染色可见成纤维细胞胞浆被染成棕黄色(×400),经免疫荧光染色可见成纤维细胞胞浆显现绿色荧光(×400)。七、TGF-β1刺激下肺成纤维细胞增殖情况随着TGF-β1刺激浓度的增加,肺成纤维细胞24小时OD值分别为0.251±0.0230.318±0.023、0.418±0.028、0.470±0.014,与0ng/ml组进行比较5ng/ml、10ng/ml组P值均＜0.05,而1ng/ml组P值＞0.05；组间比较,P值均＜0.05。随着TGF-β1刺激时间的增加,肺成纤维细胞不同时间OD值分别为0.362±0.048、0.470±0.014、0.684±0.119,与同时间对照组相比P值均＜0.05；组间比较,P值均＜0.05。八、TGF-β1刺激下肺成纤维细胞周期的变化在0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的TGF-β1刺激下,肺成纤维细胞24小时G0/G1期比例呈逐渐降低趋势,S期比例呈逐渐升高趋势,与0ng/ml组进行比较5ng/ml、10ng/ml组P值均＜0.05,而1ng/ml组P值＞0.05；组间比较,P值均＜0.05。分别用10ng/ml及0ng/ml的TGF-β1刺激肺成纤维细胞,分别于12、24、48小时测定各细胞周期,各时间点G0/G1期及S期比例与对照组相比P值均<0.05；组间比较P值均<0.05。九、TGF-β1刺激下肺成纤维细胞CDK2及P27蛋白的表达在0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的TGF-β1刺激下,肺成纤维细胞24小时CDK2蛋白表达与刺激浓度呈正比,P27蛋白表达与刺激浓度呈反比,与0ng/ml组进行比较,5ng/ml、10ng/ml组P值均<0.05,而1ng/ml组P值>0.05；对1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的TGF-β1刺激下24小时CDK2及P27蛋白的表达进行组间比较,P值均<0.05。分别用10ng/ml及0ng/ml的TGF-β1刺激肺成纤维细胞,分别于12、24、48小时测定CDK2及P27蛋白的表达,CDK2表达与刺激时间呈正比,P27与刺激时间呈反比,与同期对照相比P均<0.05；对10ng/ml刺激下12、24、48小时CDK2及P27蛋白表达进行两两比较,P值均<0.05。十、TGF-β1刺激下肺成纤维细胞CDK2及P27 mRNA的表达在0ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的TGF-β1刺激下,肺成纤维细胞24小时CDK2mRNA表达与刺激浓度呈正比,P27mRNA表达与刺激浓度呈反比,与0ng/ml组进行比较,5ng/ml、10ng/ml组P值均<0.05,而1ng/ml组P值＞0.05；组间比较,P值均＜0.05。分别用10ng/ml及0ng/ml的TGF-β1刺激肺成纤维细胞,分别于12、24、48小时测定CDK2及P27mRNA的表达,CDK2表达与刺激时间呈正比,P27与刺激时间呈反比,与同期对照相比P值均＜0.05；对10ng/ml刺激下12、24、48小时CDK2及P27mRNA表达进行两两比较,P值均＜0.05。结论1、在高浓度氧诱导新生鼠肺纤维化模型中,随着高氧暴露时间延长,肺组织CDK2蛋白及基因表达逐渐上升,P27蛋白及基因的表达逐渐下降。2、TGF-β1作用肺成纤维细胞的体外实验,证实TGF-β1可能通过上调CDK2表达下调P27的表达,刺激成纤维细胞增殖。