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布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引发的一种人畜共患传染病。布鲁氏菌能够抑制细胞的凋亡和促进细胞的自噬,导致布鲁氏菌在吞噬细胞中生存繁殖,它能引起人、畜多器官损伤和慢性感染,给人类健康和畜牧业和谐发展带来严重威胁。已有研究表明PI3K/Akt信号通路不仅参与细胞凋亡、自噬等多种细胞活动和生物学效应还与病原体在细胞内的生存繁殖密切相关,然而,该信号通路否参与了布鲁氏菌在宿主细胞内的生存繁殖尚鲜有报道,本研究通过探讨PI3K/Akt信号通路对胞内布鲁氏菌生存繁殖的影响及与布鲁氏菌介导的细胞凋亡、自噬的影响,揭示布鲁氏菌在巨噬细胞内持续性感染的分子机制,为布鲁氏菌病新药物研发、防治及家畜抗病育种工作奠定基础。目的:(1)检测布鲁氏菌及脂多糖是否激活小鼠巨噬细胞的PI3K/Akt信号通路。(2)阻断PI3K/Akt信号通路后检测对羊种布鲁氏菌16M生存繁殖在宿主体内外的影响。(3)阻断PI3K/Akt信号通路后检测对羊种布鲁氏菌16M介导的细胞凋亡的影响。(4)阻断PI3K/Akt信号通路后检测对羊种布鲁氏菌16M介导的细胞自噬的影响。(5)检测PI3K催化亚基p110α在羊种布鲁氏菌16M侵染巨噬细胞过程中的功能。从而揭示布鲁氏菌在巨噬细胞内持续性感染的分子机制,为布鲁氏菌病新药物研发、防治及家畜抗病育种工作奠定基础。方法:(1)应用Western blot技术检测:布鲁氏菌16M(16M)、其它菌株和脂多糖LPS对巨噬细胞内p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达的影响;以及16M对巨噬细胞内p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达的影响是否与侵染时间和侵染比例有关;PI3K抑制剂2-(4-吗琳基)-8-苯基-4氢-1-苯并毗喃-4酮(LY)对16M介导p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达的抑制效果。(2)抑制剂LY(LY)与巨噬细胞孵育1h,然后,用16M侵染巨噬细胞,未经抑制剂LY处理的细胞作为对照组,分别在30min、45min、4h、12h和24h检测布鲁氏菌的CFU;用ELISA检测细胞上清液中IFN-γ、IL-12p70和TNF-α的分泌。选取6-8周龄雌性BALB/c小白鼠(每组10只),腹腔注射抑制剂LY(20mg/kg/day)并持续到实验结束,给药5天后感染16M,剂量为LD100(4.6×108CFU/0.2m L)和LD50(6.3×107CFU/0.2m L),统计小鼠的死亡率;感染1×106CFU/0.2m L剂量的16M,取小鼠脾脏和肝脏,计算16M的含量;利用病理切片技术,观察病理变化。(3)抑制剂LY与巨噬细胞作用1h,然后,用16M侵染巨噬细胞,未经抑制剂LY处理的细胞作为对照组,利用caspase-3、8、9活性检测试剂盒检测其活性变化;利用实时定量PCR和Western blot检测凋亡相关基因的表达;利用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。(4)用慢病毒包装Plex-MSC-EGFP-LC3质粒,转染巨噬细胞,抑制剂LY与转染的巨噬细胞作用1h,然后用16M感染细胞,在12h和24h,用共聚焦显微镜检查EGFP-LC3绿色聚点,及溶酶体与EGFP-LC3绿色聚点的共定位;利用投射电镜观察细胞中包含16M的自噬泡的数量。(5)对p110α基因设计四条特异性阳性si RNA分子和一条阴性si RNA分子,构建sh RNA慢病毒表达载体p Lenti Lox-si RNA,将其转染巨噬细胞,通过荧光实时定量PCR技术筛选出干扰效果最好的p Lenti Lox-si RNA质粒;将最优p Lenti Lox-si RNA质粒转染RAW264.7巨噬细胞。结果:(1)布鲁氏菌16M感染细胞后,p-Akt(S473)和p-Akt(T308)在第1h表达量最高,且显著高于对照组和其他组(P<0.05),在第8h、12h和24h其水平恢复正常,与对照组相比其表达量无显著差异(P>0.05)。粗糙型的RB51、M5Δpgm感染的细胞中p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达显著低于光滑型的M5、16M和S2308(P<0.01)。抑制剂LY对16M介导的p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达的阻断具有浓度依赖性。(2)在30min、45min、4h、12h和24h,LY处理组细胞中的细菌数量显著低于对照组细胞(P<0.05)。在第10天,攻LD100和LD50剂量后16M+LY组的小鼠成活率分别为30%和60%,对照16M组小鼠成活率分别为0和30%;16M+LY组的小鼠血清中的IFN-γ、IL-12p70和TNF-α显著高于16M组(P<0.01);16M+LY组小鼠中CD8+T细胞百分比显著高于16M组(P<0.05);16M+LY组小鼠的脾脏和肝脏的病理变化都比对照16M组小鼠较轻。(3)在4h、12h和24h,16M+LY组细胞caspase-3的OD405都显著高于对照组细胞(P<0.05);caspase-9的OD405值与caspase-3趋势一致;16M+LY组细胞中Bax的m RNA相对表达量显著高于16M组细胞(P<0.01),Bcl-2 m RNA相对表达量显著低于16M组细胞(P<0.01),16M+LY组细胞中的cleaved PARP、Bax和Cytosolic Cyt-c的蛋白表达量显著高于16M组(P<0.01);16M+LY组细胞凋亡率显著高于16M组细胞(P<0.01)。(4)在12h和24h,16M+LY组的绿色荧光颗粒显著低于16M组细胞(P<0.01);16M+LY组细胞中Beclin1和ULK1 m RNA相对表达量显著低于16M组细胞(P<0.01);16M+LY组细胞中的LC3-II/LC3-I转换率、Beclin1和ULK1的蛋白水平显著低于16M组细胞(P<0.01);16M+LY组细胞中包含16M的自噬泡与16M组细胞相比明显减少(P<0.01)。(5)在30min、45min和4h,p110α基因沉默组与正常细胞组内16M的CFU无显著差异(P>0.05),但在12h和24h时差异显著(P<0.05);在12h和24h,沉默p110α基因后,与对照组相比,感染细胞的caspase-3活性显著提高(P<0.01);促凋亡相关蛋白cleaved PARP、Bax和Cytosolic Cyt-c细胞凋亡率也显著提高(P<0.01);16M介导的IL-12p70和TNF-α的水平显著提高(P<0.01)。结论:(1)布鲁氏菌及其LPS可激活PI3K/Akt信号通路。(2)抑制剂LY可显著降低16M在宿主体内和体外的存活,可提高宿主的细胞免疫抵抗16M感染。(3)抑制剂LY可显著提高16M介导的RAW264.7巨噬细胞凋亡,并且这种细胞凋亡依赖caspase-3和caspase-9的活性。(4)抑制剂LY可显著抑制16M介导的RAW264.7巨噬细胞自噬。(5)沉默p110α基因,可降低16M在胞内的存活,诱导16M介导的细胞凋亡,提高细胞免疫,对16M介导的细胞自噬无影响。