高效降解姜黄药渣木质纤维素的真菌筛选、复合菌组构建及转录组学研究

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目的:探究姜黄药渣及其堆放环境中真菌多样性,筛选高效水解药渣的真菌并建立高效复合菌组,解决药渣堆放污染环境的现状,维护生态健康;提高药渣水解率,为生物质的再利用打下基础。方法:1.利用Pac Bio Sequel高通量测序对堆放2年与5年的抗生物降解药渣进行组间真菌动态差异构成及理化性质分析,通过FUNGuild平台进行真菌基因功能及表型预测;2.通过组织分离法及摇床培养从姜黄药渣及其堆放环境中分离获得真菌菌株,采用系统发育学结合形态学方法,对分离出的菌株进行鉴定、归类,并进行多样性评估;3.将分离获得的真菌加入羧甲基纤维素钠-刚果红、马铃薯葡萄糖琼脂-苯胺蓝、木聚糖-刚果红培养基初步筛选出具有木质纤维素降解能力的菌株,再利用姜黄药渣为唯一营养物质的液体培养基进行酶活力复筛;将高效单一水解菌株以联合培养的方式测试酶活,筛选具有协同作用的复合菌组并进行减重验证;4.利用转录组学对分离出的真菌Phaeophlebiopsis sp.(ZYJHYZ254)进行基因注释和GO、KEGG功能富集分析与CAZymes基因表达预测。结果:1.从6个药渣样品中共检测到43 753条有效序列,堆放2年的药渣中,共检测到4个门、86个属、126个种,节担菌纲、小丛壳目、曲霉属为优势类群。堆放5年的药渣中检测到3个门、49个属、59个种,Chaetomium novozelandicum及小囊菌科为优势类群。对功能组成分析发现,堆放2年的药渣中腐生型真菌占比46.97%、致病真菌占比32.26%、共生型真菌占比20.77%;堆放5年药渣中腐生型真菌占比96.60%与极少数共生型真菌(0.22%)。堆放2年的药渣pH为4.90±0.20,含水量为49.15%;堆放5年的药渣pH为3.60±0.10,含水量为20.82%;2.从姜黄及其堆放环境中分离鉴定出67株真菌,分别属于3个门23个属的30个菌种,优势菌种是Bjerkandera adusta,有11株,其次是Talaromyces purpureogenus,有6株。优势菌属是Bjerkandera,其次是Aspergillus。3.通过单一聚合物固体培养基的筛选,获得具有木质纤维素降解能力的菌株共35株,根据直径比值结果进一步筛选出24株,经过6种酶活检测(纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、漆酶、木质素总过氧化物酶),发现大多数真菌在第7-9天能产较高的β-葡萄糖苷酶和纤维素酶,Aspergillus niger(ZYJHYZ242)和Fomitopsis palustris(ZYJHYZ247)的酶活性最高,纤维素降解潜力最大。在木质素降解相关酶的检测过程中,发现大多数菌株的产酶高峰出现在5-7天,其中Phaeophlebiopsis sp.(ZYJHYZ254)的过氧化物酶产量最高,在第7天达到602.96 U/L。此外,Phaeophlebiopsis sp.(ZYJHYZ254)、Piloderma sp.(ZYJHYZ268)和Coniochaeta velutina(ZYJHYZ246)也是产生木质素降解酶最高的3个菌株。在半纤维素酶活性结果中,Phaeophlebiopsis sp.(ZYJHYZ254)的木聚糖酶产量最高,且最高产酶时间为第5天,β-木糖苷酶的产量在各真菌中相似。产酶效果最好的真菌为Coniochaeta velutina(ZYJHYZ246)和Phaeophlebiopsis sp.(ZYJHYZ254)。选取9株菌共构建了12个协同真菌组合,复合菌组中除了木质素过氧化物酶以外,其他5种酶活均提升了2-3倍,减重实验发现组合10的减重效果最显著,减重率为60.34%。4.从Phaeophlebiopsis sp.(ZYJHYZ254)生长3 d与7 d的菌丝中共检测到1232个差异基因,以3 d的菌丝为对照,显著上调下调基因分别有826及406个,基因注释和GO、KEGG功能富集分析结果表明差异表达基因主要与蛋白质合成以及代谢、酶合成相关。此外,共有387个CAZymes基因表达,糖苷水解酶数量最多,约占49.61%,其次为辅助氧化还原酶(97个)与糖苷转移酶(62个),分别约占25.06%与16.02%。GH16(24个)占糖苷水解酶的12.50%,含量最多,主要编码葡萄糖苷酶、木聚糖酶等,辅助氧化还原酶中AA3(37个)占比38.14%,编码氧化酶、脱氢酶等。结论:通过高通量测序发现堆放的姜黄药渣中有许多降解木质纤维素的功能菌株,进而总共分离出302株真菌,经初筛与复筛共构建了4个高效复合菌组,并从Phaeophlebiopsis sp.(ZYJHYZ254)中发现了丰富的CAZymes基因表达。本研究为解决该类中药渣的相关制药产业环境污染及促进生态健康打下了基础,降解特殊生物质中的木质纤维素具有重要意义,为产酶功能微生物发掘了更多资源,为生物酶工业生产打下了良好基础。
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