一、研究背景到目前为止,肺癌已成为当今世界男性发病率最高的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌约占80%,诊断确立时仅30%的患者有手术机会,无手术机会的患者预后极差,及时采用放、化疗等综合治疗,大都数患者在5年之内发生肿瘤转移。尽管第三代化疗药物不断涌现,但5年生存率提高极为有限,东部肿瘤协作组(ECOG)将标准的紫杉醇/顺铂方案与其他三种含铂类方案的疗效进行对比,中位生存期、1、2年存活率的差异并无统计学意义。因此,对于非小细胞肺癌的治疗,迫切需要新的方案。生物靶向治疗的出现,给肺癌的治疗带来了新的希望。目前临床常用的肺癌靶向治疗有两个重要靶点,一个是表皮生长因子及受体(EGFR),另一个是血管内皮生长因子及受体(VEGFR),前者主要介导肿瘤细胞的增殖和生长,后者主要介导肿瘤新生血管的形成。有研究证实,肿瘤超过1～2mm~3时,其生长必须依赖肿瘤新生血管的形成,抑制肿瘤新生血管的形成能显著抑制肿瘤的增生和转移。目前发现与肿瘤新生血管有关的细胞因子有血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)等,其中血管内皮生长因子是形成新生血管最关键的因子,目前有多种方法如反义核酸技术、单克隆抗体技术、小分子RNA干扰技术、可溶性受体技术等来阻断VEGF与受体的信号转导,抑制肿瘤新生血管的形成,从而抑制肿瘤的生长和转移。树突状细胞(DC)是体内功能最强大的抗原提呈细胞,以DC为基础的抗肿瘤主动免疫成为研究热点,有学者利用DC强大的抗原提呈功能,用于抗肿瘤新生血管形成,结果令人满意。Schmitt用膀胱癌患者肿瘤细胞提取mRNA转染自体DC,与T细胞共培育,CTL应答反应明显上升,抑制肿瘤诱导的新生血管形成,具有显著的抗肿瘤转移作用。本文研究了VEGFR-2胞外区,即可溶性VEGFR-2(sVEGFR)cDNA修饰DC抗肺癌转移作用及其机制。二、材料与方法(一)实验材料1.小鼠、质粒、细胞◇C57小鼠,雌性,6-8周,6-8周雌性C57BL/6小鼠(H-2b)购自上海必凯实验动物有限公司。◇pcDNA3.1(+)载体质粒(图1),绿色荧光蛋白重组质粒pcDNA3.1/GFP。◇DH5α大肠杆菌感受态细胞◇VEGFR-2+的小鼠血管内皮细胞系H5V(H-2b):由意大利MarioNegri研究所Vecchi博士惠赠◇Lewis肺癌细胞系3LL(H-2b)获自美国ATCC2.PCR引物:由上海生物工程技术服务有限公司(SANGON)合成上游引物(P1):5’-CG GGA TCC ATG GAG AGC AAG GCGCTG-3’下游引物(P2):5’-G GAA TTC TCA TTC CAA GTT GGT CTTTTC-3’3.分子克隆及细胞培养试剂◇限制性内切酶(BamHI、EcoRI),TOYOBO公司产品◇Trizol一步法总RNA抽提试剂,Invitrogen◇RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit,Fermentas◇PCR试剂,TOYOBO◇DNA凝胶回收试剂盒,V-GENE◇pMD18-T T-A克隆试剂盒,大连宝生物技术(TAKARA)有限公司◇T4 DNA Ligase Kit,TOYOBO◇琼脂糖:上海生物工程有限公司Spanish产品分装◇胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast extract),Oxoid产品◇Rapid Plasmid DNA Daily Mini-prep Kit,V-GENE◇RPMI.1640,GIBCO◇胎牛血清(Fetal Calf Serum,FCS),杭州四季青生物工程公司(二)实验方法用Trizol一步法从表达VEGFR-2的小鼠血管内皮细胞系H5V(H-2b)提取总RNA。用First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司产品)将1μg总RNA逆转录成cDNA。PCR扩增sVEGFR-2基因片段,上游引物(P1):5’-CG GGA TCC ATG GAGAGC AAG GCG CTG-3’;下游引物(P2):5’-G GAA TTC TCA TTCCAA GTT GGT CTT TTC-3’;目的片段为2304 bp。PCR产物作琼脂糖凝胶电泳鉴定并将片段切下胶回收,T-A克隆构建pMD18-T/sVEGFR-2,T-A克隆产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,小量抽提pMD18-T/sVEGFR-2重组质粒,对抽提的质粒进行BamHI-EcoRI双酶切鉴定,对酶切鉴定正确的质粒进行测序,经测序正确的pMD18-T/sVEGFR-2质粒和pcDNA3.1(+)空载体质粒分别以BamHI和EcoRI双酶切,酶切产物分别作琼脂糖凝胶电泳,将sVEGFR-2目的片段与pcDNA3.1(+)载体大片段分别切下胶回收。将胶回收sVEGFR-2目的片段与胶回收表达载体pcDNA3.1(+)作连接反应,连接产物全部转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,37℃培养16-20h后挑选单个菌落若干扩增,小量抽提pcDNA3.1(+)/sVEGFR-2重组质粒,BamHI和EcoRI双酶切鉴定,阳性质粒为构建成功的pcDNA3.1(+)/sVEGFR-2质粒;取C57BL/6小鼠骨髓,处理后将骨髓细胞配成2×106/ml,于6孔板上,每孔加3ml,在37℃、5%CO2条件下培养,完成DC的制备;将构建成功的pcDNA3.1(+)/sVEGFR-2质粒用电穿孔法基因转染DC;酶联免疫吸附(ELISA)法测定sVEGFR-2的表达;将转染后DC免疫小鼠:将C57BL/6小鼠分为4组,经尾静脉分别给小鼠注射PBS、DC、pcDNA3.1修饰的DC(DC-vector)和pcDNA3.1/sVEGFR-2修饰的DC(DC-sVEGFR-2),每只小鼠注射剂量为100μl,连续3次,每次间隔1周;第3次免疫注射后10天,给小鼠后腿足垫内注射3LL Lewis肺癌细胞(2×105细胞/鼠,每组8～10只小鼠),当肿瘤直径达到6mm时,截去荷瘤小腿。当对照组荷瘤小鼠开始死亡时,处死各组小鼠,计数肺表面肿瘤转移灶数目。三、结果(1)PCR产物为2304bp,包括含信号肽序列的三sVEGFR-2cDNA(208～2493bp),BamHI(5’)和EcoRI(3’)两个酶切位点以及人为加上的终止密码。(2)sVEGFR-2 cDNA测序结果(5’端),与标准序列一致。(3)5个不同克隆的pcDNA3.1(+)/sVEGFR-2 BamHI和EcoRI双酶切结果均得到目的片段和载体片段,表明目的片段已成功插入到BamHI和EcoRI酶切位点之间,所构建的质粒正确。(4)用电穿孔法将pcDNA3.1/GFP转染DC,转染效率为71%。经sVEGFR-2转染的DC可有效表达sVEGFR-2,而DC-vector和DC不表达sVEGFR-2,统计学有非常显著差异(P＜0.01)。(5)经DC-sVEGFR-2免疫的小鼠肺转移灶数目明显减少,与对照组相比,差异有非常显著的意义(P＜0.01)。四、讨论新生血管的生成是肺癌生长和转移的基础,如果没有肿瘤新生血管提供营养和氧气,肿瘤长到1～2mm~3就会停止生长。血管内皮生长因子及受体是重要的血管生成正性调节因子,与肺癌增殖和转移有着十分密切的关系。血管内皮生长因子及其受体是目前肺癌靶向治疗的重要靶点。树突状细胞是体内专职的抗原提呈细胞,具有独特的刺激T细胞增殖的能力,是机体免疫应答的始动因素,是一种天然的免疫佐剂。应用sVEGFR-2基因转染的树突状细胞疫苗,能高水平地表达sVEGFR-2,中和VEGF,打断VEGF/VEGFR的信号转导途径,抑制肿瘤新生血管形成;此外,还去除了VEGF对树突状细胞的抑制,提高树突状细胞数量和质量,提高机体的免疫应答水平。经sVEGFR-2基因转染的树突状细胞疫苗,还可以诱导机体针对VEGFR的特异性免疫应答,直接杀伤新生血管的内皮细胞,强烈抑制新生血管的生成,从而肿瘤的生长和转移。从本研究结果分析,由于3LL Lewis肺癌细胞本身不表达VEGFR-2,经DC-sVEGFR-2免疫的小鼠抗肺癌细胞转移并不是对肺癌细胞的直接杀伤,进一步说明新生血管形成在肿瘤生长和转移中的作用。由于血管内皮细胞具有遗传稳定性,以此为靶点可以减少耐药性的产生,具有一定优势。但由于制备复杂及临床相关安全性问题,DC-sVEGFR-2运用于临床,尚有许多亟待解决的问题。五、结论1、DC-sVEGFR-2能有效表达sVEGFR-2,而DC-vector和DC不表达sVEGFR-2。2、DC-sVEGFR-2免疫显著抑制实验性肺肿瘤的转移。