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哮喘是一种人类肺部疾病,又被称作支气管哮喘,其本质是一种慢性气道炎症,是由于多种细胞与细胞组分参与致病的。哮喘的主要症状表现为气促、胸闷、喘息和(或)咳嗽等。由于汽车尾气,工业废气等多种有害气体排放引起的大气污染日益严重,同时由于人们生活节奏的加快、不良的生活习惯,导致哮喘的发病率逐年增加,并且呈现出越来越年轻化的趋势。有些幼龄儿童患有严重哮喘,给其生活与家庭带来痛苦和负担。虽然我国哮喘的发病率低于一些发达国家,但是死亡率较高,可达10万分之36.7,位居全球第一位。总之,哮喘不仅为人们的健康带来巨大的损害,给人们的生活带来很多不便,而且给社会带来很大的经济负担,值得我们的重视。多项研究发现哮喘的遗传率高达80%,从而证明遗传效应在哮喘的发作中起着非常重要的作用。近年来科学界进行了多项全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS)来探索哮喘的潜在遗传机制。GWAS找到了多个与哮喘发病相关的遗传标记,大大深化了人类对于哮喘发病机理的认识。例如,11q13.5区域的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记rs7130588和5q31.1区域的rs1295686被发现与哮喘显著相关。但GWAS发现的只是遗传标记,而无法解释这些突变的致病机理。本课题研究的意义:本课题在GWAS的研究基础上,利用千人基因组计划数据,搜索连锁位点为潜在致病位点。利用功能基因组学手段,筛选有功能的致病基因位点,并且研究其表达调控机制。本研究有助于加深我们对哮喘遗传机制的认识,并对其筛查、预防、治疗也具有一定的意义。研究内容与结果:对相关位置的千人基因组数据进行分析,获得与rs7130588和rs1295686强连锁的位点为潜在功能性位点。对这些位点构建质粒,并使用定点突变生成只有一个碱基差异的质粒。将这些质粒转染肺细胞,观察突变对于增强子活力的影响。利用染色质构象捕获(chromosome conformation capture,3C)评估该增强子和附近基因启动子之间远端基因组DNA区域的相互作用,并进行染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)实验来寻找结合在该突变上的转录因子。实验结果显示:1.在基因组11q13.5区域,与rs7130588强连锁的突变只有一个,为rs6592645(r2=1)。荧光双报告实验表明,rs7130588两个等位基因的增强子活力在肺细胞中并无差异(P=0.487),而rs6592645位点的T等位基因,比C高出～4.2倍(P=0.000125),这表明引起哮喘的功能性位点是rs6592645,而不是rs7130588。通过3C实验发现,rs6592645所在的增强子,与周围的蛋白质编码基因并无空间接触,表明这些基因都不是该增强子的作用基因。ChIP实验发现,结合在rs6592645上的转录因子为TCF3(transcription factor 3)。5q31.1中,与rs1295686强连锁的位点有四个,分别为rs20541,rs1295685,rs848,rs847。荧光双报告发现,rs1295686和rs20541两个等位基因的相对增强子活力并无显著差异(P分别为0.93和0.15)。而rs1295685的G,rs848的C和rs847的C等位基因分别可将相对增强子活力下降～90%(P=3.7X 10-13)、～97%(P=4.14X 10-14)和～97%(P=3.73X 10-14),表明这三个SNP位点是导致哮喘的功能性位点。3C实验发现,一个长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)helper type 2 locus control region associated RNA)的启动子与该增强子存在空间接触,是该增强子的调控目标基因。TH2LCRR与细胞因子分泌相关,可能通过影响人体免疫系统从而引发哮喘发生。ChIP实验表明,rs1295685,rs848,rs847三个SNP位点分别结合的转录因子为TCF3,USF1(upstream transcription factor 1),HNF4A(hepatocyte nuclear factor 4 alpha)。研究的主要目标:揭示人类基因组11q13.5和5q31.1区域中与哮喘相关的真正功能变异及其作用机制。论文的创新点:本实验在GWAS的研究基础上确定了真实致病位点,并阐明了其与哮喘相关的分子机制。实验结论:11q13.5区域导致哮喘相关的突变为rs6592645,通过改变转录因子TCF3结合能力,调控增强子活力,进而影响哮喘易感性。5q31.1区域导致哮喘的突变为rs1295685,rs848和rs847,分别通过改变转录因子TCF3、USF1和HNF4A的结合能力,改变增强子活力,调控TH2LCRR的表达,并影响个体哮喘易感性。