论文部分内容阅读
背景动物实验表明,大鼠经致死量脂多糖(LPS)处理后,TNF、IL-1b等早期致炎因子一般都在6h内达到高峰,然后很快降回基础水平,而大鼠仍在攻击后数日内死亡。这一现象提示内毒素血症致死亡过程中,存在一种迟发递质在起作用。用LPS刺激大鼠RAW264.7细胞,发现LPS刺激后18h即可诱发一种分子量为30 000道尔顿(30kDa)的蛋白质的出现,而在早期此种蛋白质并不突出。分析证实这种迟发递质为大鼠高迁移率族蛋白B1(HMGB1)。HMGB1是高迁移率族蛋白超家族(high mobility group, HMG)成员, HMG包括HMGB、HMGN、HMGA三大家族,其中HMGB1含有2个由约80个氨基酸组成的“L”型HMG box,分别是A box (1-85aa)和B box (88-162aa),是结合DNA的功能结构域。其中B box是HMGB1发挥致炎功能的主要区域,而A box却能竞争性抑制HMGB1的致炎功能。巨噬细胞、单核细胞在IL-1、TNF刺激后在胞内形成富含HMGB1的囊泡,细胞再以胞吐的方式将HMGB1释放至胞外;同时,HMGB1也可刺激巨噬细胞、单核细胞释放致炎因子,如TNF、IL-1α、IL-1b、IL-6、IL-8等。其中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种具有广泛生物学活性的细胞因子,主要由激活的巨噬细胞和淋巴细胞产生。如内毒素刺激可引起体内TNF-α的释放,而TNF-α的释放可以引起其他因子如IL-1、集落刺激因子(CSF)等的释放。这些细胞因子在机体炎症的启动、维持、消退等方面都起着重要的作用。白细胞介素10(IL-10)是一种重要的抑炎因子,又名“细胞因子合成抑制因子”,其主要的生物学特点是激活单核-巨噬细胞抑制炎症细胞因子产生,促进B细胞的释放和免疫球蛋白分泌,对巨噬细胞的功能有免疫抑制作用。HMGB1、TNF-α和IL-10三种因子在各自的生物学特点上有所不同,在脓毒症的发生、发展、变化过程中起着不同的作用,同时三者之间又相互联系。阐明三者间的相互关系,将对今后脓度症的基础研究以及临床治疗方面提供有用的线索和信息。目的以急性梗阻性化脓性胆管炎(AOSC)内毒素血症患者为研究对象,测定脓毒症患者血液中HMGB1、TNF-α和IL-10基因和蛋白的表达,初步探讨HMGB1在脓毒症患者血液中的表达情况,分析其临床意义,为脓毒症的临床治疗提供相关理论依据。方法按脓毒症的定义和诊断标准,以2003年国际脓毒症讨论会定义的脓毒症诊断标准为准选择病例[29]。脓毒症是指因感染引起的全身性炎症反应(SIRS),体温、循环、呼吸有明显的改变,是机体对感染的全身性反应,具有2项SIRS的条件(SIRS+感染证据)。SIRS包括下列两项或两项以上体征:体温>38℃或<36℃;心率>90次/min;呼吸>20次/min;PaC02<4.27 kPa;外周血白细胞计数>12×109/L或<4×109/L,或末成熟粒细胞>10%。AOSC为脓毒症的典型代表,按照人民卫生出版社,2003.7第6版本科医学教材.外科学关于AOSC诊断标准: Reynolds五联征:(1)腹痛(2)寒战高热(3)黄疸(4)休克表现(5)神经中枢系统受抑制表现;实验室检查:(1)白细胞记数和中性粒细胞升高(2)血小板记数降低(3)凝血酶原时间延长等;影像学检查;或胆道感染的Charcot三联征:(1)腹痛(2)寒战高热(3)黄疸;体温39℃以上,脉搏>120次/分,白细胞>20×109/L,血小板记数降低。满足以上条件的病例纳入研究范围,共纳入23例病例。健康志愿者,排除机体内有感染存在,共纳入23例病例。1.HMGB1 B box基因转录水平的差异:正常人外周血和手术前和手术后12h、24h、36h AOSC病人外周血单个核细胞提取细胞总RNA,RT-PCR扩增人HMGB1 B box cDNA。总RNA提取和RT-PCR试剂盒均购买商品化成品,RT-PCR采用两步法,对提取的总RNA和RT-PCR产物分别做琼脂糖凝胶电泳。2.HMGB1 B box基因表达水平的差异:对AOSC病人手术前和手术后12h、24h、36h和正常人血清中HMGB1的含量做Western-blot(免疫印记)检测。3.TNF-α和IL-10差异:采用ELISA(酶联免疫吸附)法检测正常人外周血和手术前和手术后AOSC病人外周血中TNF-α和IL-10含量的变化。4.对以上三项检测的结果均应用SPSS12.0统计软件进行统计学分析。结果RT-PCR结果显示,在典型的脓毒症-急性梗阻性化脓性胆管炎患者中,外周血单个核细胞中HMGB1 mRNA表达量(0.82±0.04)比正常对照(0.31±0.06)明显增高(P<0.01),胆道引流术后12小时为0.46±0.05,24小时为0.38±0.07,与手术前相比逐渐降低(P<0.01)。Western blot检测结果显示,在典型的脓毒症-急性梗阻性化脓性胆管炎患者中,外周血血清中HMGB1蛋白的表达量(0.81±0.03)比正常对照(0.35±0.05)明显增高(P<0.01),胆道引流术后12小时为0.56±0.05,24小时为0.36±0.07,与手术前相比逐渐降低(P<0.01)。ELISA结果显示,AOSC患者血清中TNF-α与IL-10的含量分别为469±35pg/ml和33.369±6.443pg/ml比正常对照(102±16pg/ml、11.490±1.088pg/ml)明显增高(P<0.01);治疗后随着病情好转,手术后12小时分别为243±26 pg/ml和20.562±5.630 pg/ml,与手术前相比逐渐降低(P<0.01)。结论(1)AOSC患者外周血中HMGB1蛋白的含量和mRNA表达量比正常对照明显增高;(2)胆道引流术后随着病情好转,AOSC患者外周血中HMGB1蛋白的含量和mRNA表达量明显降低;(3)HMGB1是反映脓毒症病情危重程度的一个有效指标。