论文部分内容阅读
非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)已被公认为全球最主要的公共卫生问题之一。越来越多的研究表明,NAFLD患病不局限于高脂、高热量饮食,还涉及了环境因素和宿主遗传学之间复杂相互作用,慢性心理应激便是NAFLD可能的重要病因之一。值得一提的是,心理应激理论与中医情志致病理论具有多层面的一致性,结合“脏腑体用相关”学说理论观点,及中药复方四逆散对慢性心理应激疾病及NAFLD临床中的卓越疗效,不仅在中医理论层面给出了阐释慢性心理应激启动、介导NAFLD的依据,并且为揭示四逆散治疗慢性心理应激相关NAFLD方效机制提供了可能。然而慢性心理应激影响NAFLD网络机制复杂,因此本研究首先采用网络医学分析方法,预测并分析慢性心理应激启动、介导NAFLD疾病过程的核心网络机制。在DiseaseGene Network数据库共收集获得了 NAFLD的333个相关靶点,慢性心理应激相关靶点930个;采用基因映射共获得慢性心理应激与NAFLD的79个相关交互靶点,并在STRING数据库建立了一个79个节点,239条边的蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)网络(阈值≥0.7 的蛋白交互关系);在 Cytoscape 软件与DAVID数据库对PPI网络进行拓扑分析与富集分析,共获得了 31个具有拓扑重要性的假定目标靶点及21个相关作用通路(P<0.05),6个核心作用通路(P<0.01,FDR<0.01),结合已有的一些相关研究分析网络医学预测的“靶点-通路”网络提示,核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白 3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体可能在慢性心理应激诱发、加重NAFLD疾病过程中发挥着关键作用。因此,实验验证聚焦炎症层面,慢性心理应激激活NLRP3炎症小体,从而调控炎症因子释放,并介导炎症反应,以炎症反应为中轴通过“神经-炎症-代谢”网络启动、介导NAFLD的分子机制,研究设立空白组、慢性应激(Chronic Stress,CS)组、高脂饮食(High Fat Diet,HFD)组、复合模型组(复合组),一般情况结果显示,CS组与复合组均出现显著的抑郁样行为学表现;代谢层面上,CS组、HFD组、复合组均出现显著的NAFLD病理表现,其中CS组相较空白组,肝指数(P<0.01)、肝脏总甘油三酯(Total glyceride、TG)含量(P<0.01)、油红O染色面积(P<0.01),天冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)(P<0.01)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、碱性磷酸(酯)酶(Alkalinephosphatase,ALP)(P<0.05)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)(P<0.01)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)(P<0.01)、游离脂肪酸(Free Fat Acid,FFA)(P<0.01)均显著升高,高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)显著降低(P<0.01),表明慢性应激可以诱发NAFLD,而复合组相较HFD组,肝重、肝指数、肝脏TG含量、油红O染色面积(P<0.01),AST、ALT、FFA显著升高均显著升高(P<0.01),表明慢性应激可以促进NAFLD疾病过程。神经层面上,CS组与复合组血清糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)含量相较空白组与HFD组均显著升高(P<0.01),海马体糖皮质激素受体(Glucocorticoid Recepter,GR)mRNA相对表达量有降低的趋势,但尚未有显著的统计学差异。炎症层面上,CS组相较空白组,肝脏NF-κB、NLRP3mRNA相对表达量显著升高(P<0.01),肝脏核因子 kappa-B(Nuclear factor kappa-B,NF-1κB)、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speckle-like protein containing CARD,ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)含量显著升高(P<0.01),肝组织与血清内白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)含量均显著升高(P<0.01);复合组相较 HFD 组,肝脏NLRP3相对表达量显著升高(P<0.05),肝脏NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1含量显著升高(P<0.01),肝组织与血清内IL-1β、IL-6、TNF-α含量均显著升高(P<0.01)。相关性分析显示,肝组织NLRP3与血清GC存在显著相关性(P<0.01),肝组织NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α与肝组织TG均有显著的相关性(P<0.01)。网络医学结合实验验证的结果表明,慢性心理应激可以通过作用于79个相关靶点(其中31个核心靶点),21个相关作用通路(其中6个核心作用通路),以NLRP3炎症小体的激活与炎症因子释放,及其介导的炎症反应为核心通过“神经-炎症-代谢”网络启动、介导NAFLD疾病过程。并提示,靶向作用于NLRP3炎症小体及其调控的炎症因子可能成为治疗慢性心理应激相关NAFLD的关键。研究进一步采用网络药理学结合实验验证的方法明确四逆散作为中药复方治疗慢性心理应激相关NAFLD多靶点、多途径作用的核心效应机制。在TCMSP、SymMap、ETCM、NPASS数据库共收集四逆散的779种化合物,经ADME参数与里宾斯基五规则筛选后共获得四逆散125个化学结构上不同的、具有成药性的化合物成分,及这些化合物成分相应的311个潜在作用靶点;采用基因映射收集了四逆散与慢性心理应激相关NAFLD的20个交互靶点,约占慢性心理应激相关NAFLD疾病相关靶点的25.3%,约占核心靶点的54.8%,其中炎症因子靶点占比30%。在STRING数据库建立四逆散治疗应激相关NAFLD的20个预测靶点的PPI网络,选取阈值≥0.7的蛋白交互关系,获得了一个20个节点,80条边的PPI网络;采用拓扑分析,获得了四逆散治疗慢性心理应激相关NAFLD的8个具有拓扑重要性的假定目标靶点,在8个核心作用靶点中,炎症因子靶点占比50%。在DAVID数据库进行富集分析,分析结果包括23个作用通路(P<0.05),其中2个核心通路(P<0.01,FDR<0.01)。结合已有研究及实验一、实验二研究结果,分析网络药理预测的“靶点-通路”网络提示,四逆散可能通过抑制NLRP3炎症小体改善应激相关非酒精性脂肪肝病的炎症反应。实验验证设立空白组、复合模型组(复合组)、四逆散治疗组(四逆组)、阳性药治疗组(阳性组),一般情况结果显示,复合组、四逆组、阳性组均出现显著的抑郁样行为学表现,而经过1周的治疗四逆散可以显著改善抑郁样行为。代谢层面上,复合组、四逆组、阳性组均出现显著的NAFLD病理表现,在经过四逆散和辛伐他丁治疗1周后,四逆组、阳性组相较复合组,肝重、肝指数、肝脏TG含量、油红O染色面积,AST、ALT、ALP、TG、TC、FFA、LDL 均显著降低(P<0.01),HDL 显著升高(P<0.01)。神经层面上,复合组相较空白组,血清GC含量显著升高(P<0.01);四逆组相较复合组血清GC含量显著降低(P<0.01),阳性组相较复合组无显著性改变。炎症层面上,复合组相较空白组,肝脏NF-κB(P<0.01)、NLRP3(P<0.05)、ASC(P<0.01)、Caspase-1(P<0.01)的mRNA相对表达量显著升高,肝脏NF-KB、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白含量显著升高(P<0.01),肝脏与血清IL-1β、IL-6、TNF-a含量均显著升高(P<0.01);四逆组、阳性组相较复合组,肝脏内NF-κB、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白含量均显著降低(P<0.01),肝脏与血清IL-1β、IL-6、TNF-a含量均显著降低(P<0.01)。结果表明,与慢性心理应激相关NAFLD方效与病机相符的四逆散复方中含有的125种化学结构不同的、具有成药性的化合物,可以通过作用于20个相关靶点(其中8个核心靶点),23个相关作用通路(其中2个核心作用通路),以抑制NLRP3炎症小体及其调控的炎症因子介导的炎症反应为核心,通过调节“神经-炎症-代谢”网络的一种多通路、多靶点的网络效应机制治疗慢性心理应激相关NAFLD,此外还涉及了对与NAFLD密切相关的胰岛素抵抗、氧化应激等生物学过程的调节作用。