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第一部分 DAPT抑制破骨细胞的分化目的:观察DAPT,一种γ分泌酶(γ-secretase)抑制剂对骨髓源巨噬细胞(BMMs)在核因子κB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导下的影响。方法:应用3-5周龄C57/BL6小鼠股骨、胫骨的BMMs为体外实验研究对象,使用完全培养基(α-MEM)培养细胞以达到理想的贴壁数量和状态,使用CCK-8法检测DAPT对细胞的毒性作用;使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法观察不同浓度的DAPT在RANKL和M-CSF诱导下对破骨细胞形成的影响;使用骨吸收培养板检测不同浓度的DAPT在RANKL和M-CSF诱导下对破骨细胞功能的影响;使用RT-qPCR技术检测不同浓度的DAPT在RANKL和M-CSF诱导下对破骨细胞中NFATc1、TRAP、c-Fos、CtsK、CTR、DC-STAMP等相关基因的表达量的影响。结果:CCK-8 结果显示,在 48h、72h、96h 时,DAPT 的 IC50 分别为 316.2μM、281.8μM 288.4μM,且仅在DAPT浓度大于80μM时细胞活性有显著下降,远远高于本实验所用的最大工作浓度(10μM)。TRAP染色结果显示,BMMs在RANKL和M-CSF诱导下可以分化为成熟的破骨细胞(191个/孔),而随着DAPT浓度增加,破骨细胞的数量显著降低,在DAPT浓度为10μM时,破骨细胞数量仅为16个/孔,其差异有统计学意义(p<0.05)。骨吸收培养板检测结果显示BMMs在RANKL和M-CSF诱导下骨吸收面积达到了 76.8%,而在DAPT浓度为2.5μM、5μM、10μM时,骨吸收面积分别为39.9%、14.2%、6.8%,差异均有统计学意义(p<0.05)。RT-qPCR结果显示,和对照组相比,加入DAPT后破骨细胞相关基因NFATc1、TRAP、c-Fos、CtsK、CTR、DC-STAMP的表达量均有显著下降(p<0.05),且呈现浓度依赖性。结论:适宜浓度的DAPT能有效抑制BMMs分化为成熟破骨细胞,并可以显著影响破骨细胞行使相关功能。第二部分 DAPT抑制破骨细胞分化的机制研究目的:阐释DAPT对骨髓源巨噬细胞(BMMs)在RANKL和M-CSF诱导下的作用机制。方法:以小鼠BMMs为研究对象,使用Western blot蛋白印迹法检测BMMs在RANKL 和 M-CSF 诱导下 NFATc1、NICD2、HES-1、IκBα、p65、p-p65 等蛋白的表达量;运用计算机模拟分子对接技术预测DAPT对p65蛋白的潜在作用靶点。结果:Western blot 结果显示 RANKL 和 M-CSF 能够显著增加 NFATc1、NICD2、HES-1、p65、p-p65 蛋白的表达。加入 DAPT 后,NFATc1、NICD2、HES-1、p65、p-p65的表达均下调,但IκBα表达量无明显下降。运用计算机模拟分子对接技术模拟了 DAPT对p65蛋白的潜在作用靶点在Arg-201和Ser-203的位点上。结论:DAPT可以通过阻断NF-κB和Notch2信号通路,影响BMMs向破骨细胞增殖分化,其潜在作用靶点是p65蛋白的Arg-201和Ser-203。因此,可以以此信号轴为干预对象,阻断破骨细胞过度活化造成的假体周围骨质破坏。第三部分 DAPT抑制钛颗粒诱导小鼠颅骨骨溶解的作用目的:探讨DAPT对钛颗粒造成的小鼠颅骨骨溶解的治疗作用,为临床应用提供理论依据。方法:采用随机数字表法,将选取的8周C57/BL6雄性鼠20只随机分成4组:假手术组(Sham),钛颗粒组(Vehicle),DAPT低治疗剂量组(Low),DAPT高治疗剂量组(High),每组5只小鼠。Sham组接受假手术,术后每天腹腔注射PBS;Vehicle组、Low组和High组在小鼠颅骨沿颅中缝两侧均匀埋入预处理的钛颗粒,Vehicle组术后每天腹腔注射PBS,Low组和High组分别腹腔注射0.5mg/kg/day和2mg/kg/day的DAPT。连续注射14天后,使用CO2箱处死小鼠,解剖分离小鼠颅骨样本,行Micro-CT、组织病理染色等。结果:Micro-CT三维重建显示Vehicle组小鼠颅骨骨溶解显著,而DAPT治疗组的骨溶解现象明显有所减轻。Low组和High组的骨体积分数(BV/TV%)比Vehicle组分别增加了 15.9%和29.1%;而Low组和High组的骨陷窝数比Vehicle组分别减少了 42.2%和65.6%,差异均有统计学意义(p<0.05)。组织病理染色结果显示,Vehicle组骨膜内有许多TRAP阳性细胞和炎症细胞,而DAPT治疗组的TRAP阳性细胞和炎症细胞有明显减少(p<0.05)。结论:DAPT可以显著缓解钛颗粒造成的小鼠颅骨骨溶解并减轻其炎症反应。