酵母半乳糖代谢基因受半乳糖诱导表达,并且依据外界碳源的不同有三种基因表达方式：当以葡萄糖作为碳源时,与葡萄糖有关的各种抑制元件如Mig1可以结合在GAL基因上游的抑制元件结合区域抑制GAL基因的表达；另一方面,转录激活因子Gal4虽然能够结合在UAS序列上,但此时转录抑制因子Gal80结合在其转录激活区域(TAD),抑制着转录激活因子Gal4的活性,从而抑制GAL基因的转录,这时GAL基因处于抑制状态；甘油／乳酸盐或棉子糖等非发酵碳源培养时,即细胞处在非抑制非诱导条件时,各种葡萄糖抑制元件从GAL基因上游离开,解除了葡萄糖抑制效应,但此时Gal80仍然结合在Gal4的转录激活区域,抑制着Gal4的转录活性,这时GAL结构基因仍然不能大量表达。然而与抑制条件不同,此时半乳糖信号感应蛋白Gal3已经有表达了,所以此时GAL只有基础水平的转录；半乳糖做为碳源时,半乳糖,ATP以及信号感应蛋白Gal3能够与转录抑制因子Gal80结合,使得Gal80能够从结合在酵母半乳糖代谢基因gal的上游激活序列(UAS)上的GAL4／GAL80复合物上脱落,使得转录激活因子Gal4激活区域得以暴露,从而可以募集RNA聚合酶以及各种与转录有关的辅助因子,进而启动下游的参与半乳糖分解代谢有关酶的基因的表达。这种诱导作用体现在快速和高效上,几分钟就有高达1000倍以上的转录水平上的提升；在非抑制非诱导和诱导条件下,转录激活因子Gal4激活gal基因的转录的过程中伴随着Gal4本身的降解.这种降解作用是依赖于泛素介导的蛋白酶体途径实现的,在整个途径中,泛素连接酶起到对靶蛋白特异性识别的作用：在非诱导条件下,有转录激活作用的Gal4的837位丝氨酸被与RNA聚合酶Ⅱ全酶有关的激酶Kin28磷酸化,泛素连接酶(E3)Grr1识别这种磷酸化修饰的Gal4,在泛素激活酶(E1),泛素结合酶(E2)的作用下实现Gal4的多泛素化,给其打上被降解的标签,通过26S蛋白酶体来降解。经研究表明,在△Grr1菌株中,Gal4不能被正常的降解而有着一定程度的积累,此时GAL基因的表达水平有着几十倍的提升,说明了Gal4的积累造成了GAL基因表达水平的升高,这时泛素连接酶Grr1介导的Gal4的降解方式与Gal4的转录活性的调控无关；在诱导条件下,有转录激活活性的Gal4的699和837位的丝氨酸分别被与RNA聚合酶Ⅱ全酶有关的激酶Srb10和Kin28磷酸化,泛素连接酶Dsg1识别有活性的磷酸化的Gal4,使其多泛素化进而被蛋白酶体降解。然而在△dsg1菌株中,磷酸化修饰的Gal4虽然能够大量积累,GAL基因也能够大量的转录产生mRNA,但生成的mRNA都是有缺陷的并不能正常的进行翻译,所以这是菌体表现为不能够利用半乳糖。可见与Grr1介导的Gal4的降解方式不同,Dsg1介导的Gal4的降解方式还与基因的表达调控有关,很可能泛素连接酶Dsg1本身出了识别降解Gal4外,本身还直接参与了GAL基因的转录调控过程。此外通过对转录激活因子Gal4的翻译后修饰-单泛素化可以稳定19S蛋白酶体亚基在启动子上的结合,从而调控GAL基因正常表达；单泛素化修饰的缺陷直接导致GAL基因的诱导表达缺陷。可见泛素-蛋白酶体这条降解途径除了降解靶蛋白的同时还发挥了非降解性的调控作用：对酵母半乳糖代谢基因的转录从不同阶段不同步骤中发挥了重要的调控作用。这无疑是一种全新的调控机制,对于真核生物基因复杂的转录调控机制的探索有着重要的作用。petite mutant亦简称小菌落,是酵母菌的一种突变型。在六七十年代,就发现了小菌落在半乳糖,麦芽糖等碳源上生长的缺陷,从而提出了线粒体中有控制着对不同糖利用的因子。而诱导条件下介导Gal4降解的Dsg1还控制着与线粒体外膜融合相关的Fzo1(GTPase)的降解,Dsg1的缺失同时也造成了线粒体形态的异常。因而Dsg1对于半乳糖代谢的影响是否与线粒体的功能异常有关还不清楚；线粒体中存在着催化物质代谢和能量转换的各种酶和辅酶,因而供能物质(如糖酵解产物丙酮酸)在线粒体内能得到彻底氧化分解,生成更多的高能磷酸化合物ATP以备细胞其它生命活动需要。细胞生命活动中所需能量约有95%来自线粒体。因此,线粒体的主要功能是进行细胞的氧化供能,故有细胞内“动力工厂”之称。在半乳糖代谢过程中,ATP直接参与了GAL基因的表达调控,这也从另一方面暗示了线粒体的产能与半乳糖的正常利用有关。另一方面,NADPH是生物体的一种重要辅酶,它不仅在生物合成反应中负责提供还原力,而且对于细胞抵抗活性氧的毒害也有重要作用。最近有研究表明,辅酶因子NAD(H)/NADP(H)能够直接和转录抑制因子Gal80结合来直接调控Gal4和Gal80之间的关系：当NAD(H)与Gal80结合时,能够稳定Gal4-Gal80之间的关系；而当NADP(H)与Gal80相结合时,能够去稳定Gal4-Gal80之间的关系从而有利于GAL基因的表达。而线粒体又是提供还原力的主要场所,能为细胞抗氧化做很大的贡献。因而线粒体中的NAD(H)/NADP(H)水平是否特异性调控GAL基因的表达成为了本论文研究的一个重点,对于更深层次揭示GAL基因调控机制有着重要的作用。作为单细胞真核生物的酿酒酵母,本身不仅具有高度的遗传可操作性,而且过去几十年以其作为模式生物的研究已经使人们对一些基础的细胞生物学过程及人类一些复杂疾病,如Creutzfel-Jacob病、Parkinson’s病及癌症等发生机制的认识上取得了许多关键性的进展。与此同时,酿酒酵母作为分子生物学研究的三大模式生物之一,对许多基因的转录调控相关问题的研究具有其它生物无可比拟的独特优势。本论文工作在对半乳糖代谢调控进行较为系统研究的基础上,就转录激活因子Gal4的新的活性调控方式以及Gal4-Gal80相互作用关系对GAL基因的调控上进行了系统研究,对可能的作用机制进行了初步探讨。本文主要的工作内容及结果如下：1.通过构建不同的基因缺失菌株和Gal4的定点突变或是部分缺失突变体,从遗传学角度和体外的实验探索了Gal4-Gal80之间的相互作用模式的改变对Dsg1调控GAL基因的影响机制通过检测Gal4的699位丝氨酸,837位丝氨酸和两个位点都突变的点突变体在野生型菌株和△dsg1菌株中的报告基因的活性显示,这两个位点的磷酸化对于Dsg1的调控没有影响,即Dsg1对于GAL基因的调控并不是通过这两个位点的磷酸化来实现的；与以前文献报道不同,在半乳糖为碳源的平板的生长实验表明△dsg1菌株与野生型菌株相比,表现出了延迟生长的表型而不是不生长,这也与△dsg1菌株中的GAL基因诱导曲线相符,很可能Dsg1只是影响了GAL基因的初期诱导。Western实验结果表明,Dsg1的缺失并没有影响Gal4的泛素化,一方面Dsgl影响GAL基因表达不是通过对Gal4的泛素化来实现的,另一方面很可能存在有其他的泛素化Gal4的泛素连接酶。由于Dsg1还特异性识别降解与线粒体外膜融合相关的蛋白Fzo1,因而Dsg1缺失造成了线粒体形态的异常。但与线粒体分裂相关的基因dnm1缺失时能够部分回补线粒体形态上的不正常,通过检测△dnm1,△dnm1△dsg1菌株中的报告基因活性发现,线粒体形态的部分恢复能够部分恢复GAL基因的诱导表达,暗示了Dsg1对GAL基因的调控可能与线粒体的功能异常有关。当在gal80缺陷菌株或是不与Gal80相互作用或相互作用减弱的Gal4的突变体中,检测报告基因的活性发现△dsgl菌株中GAL基因恢复了正常的诱导；同时体内的酵母双杂交实验和体外的实验证明了回补Dsg1缺失的Gal4的突变体确实与转录抑制因子Gal80之间的相互作用减弱了。当检测与Gal80恢复正常的相互作用的Gal4的突变体的报告基因时,Dsg1缺失所造成的GAL基因诱导缺陷又存在了,充分说明了Gal4-Gal80之间的相互作用模式改变对Dsg1调控GAL基因有很大的影响。2.通过构建线粒体bc1复合物的RIP1基因缺失菌株和ATP合成酶的ATP1基因缺失菌株,检测当酵母细胞胞内能量状态异常时对于GAL基因表达的影响及其机制通过检测△rip1,△atp1菌株中的报告基因活性,结果显示GAL基因没有表达。提取△rip1,△atp1菌株中的mRNA,检测GAL1的(?)nRNA是否有转录,结果表明,△rip1,△atp1菌株中没有mRNA生成；CHIP实验进一步表明无论是RNA聚合酶还是羧基末端功能区5-丝氨酸磷酸化的RNA聚合酶都不能正常的结合启动子,造成GAL基因不能转录,从而△rip1菌株不能够正常的利用半乳糖。为了确定△rip1和△atp1基因是否真正影响了细胞内的ATP水平,我检测了基因缺失菌株中ATP浓度,结果显示胞内的ATP浓度与野生型菌株相比确实下降了很多；由此可以推断△rip1和△atp1由于影响了ATP的合成,造成了胞内ATP浓度的降低从而引起了GAL基因的转录缺陷。因为胞内各种代谢途径都会受到ATP水平的影响,因而RIP1和ATP1基因的缺失对半乳糖代谢的影响是否具有特异性?通过进一步对组成型表达基因ADH1和PMA1的mRNA的检测,结果显示ADH1和PAA1在野生型和△rip1和△atp1菌株均能正常的转录；葡萄糖和半乳糖为碳源的平板生长结果表明,野生型和△rip1和△atp1菌株均能正常的在以葡萄糖为碳源的平板生长,而以半乳糖为碳源的平板上△rip1和△atp1菌株均不能正常的生长。以上结果表明了RIP1和ATP1基因的缺失引起的胞内ATP水平的降低能够特异性的导致GAL基因转录缺陷。3.通过构建线粒体中NAD(H)激酶POS5基因缺失菌株和细胞质中NAD激酶UTRl的基因缺失菌株,检测酵母细胞胞内NAD(H)／NADP(H)水平对GAL基因表达的影响及其机制通过检测Δpos5和Δutr1菌株中的报告基因活性,结果显示GAL基因没有表达。提取Δpos5和Δutr1菌株中的mRNA,检测GAL1的mRNA是否有转录,结果表明,Δpos5和Δutr1菌株中没有mRNA生成；CHIP实验进一步表明无论是RNA聚合酶还是羧基末端功能区5-丝氨酸磷酸化的RNA聚合酶都不能正常的结合启动子,造成GAL基因不能转录,从而Δpos5菌株不能够正常的利用半乳糖。为了确定POS5和UTR1基因是否真正影响了细胞内NAD(H)／NADP(H)的水平,通过检测基因缺失菌株中NAD(H)／NADP(H)浓度,结果显示胞内的NAD(H)浓度与野生型菌株相比基本没有影响,而胞内NADP(H)的水平确实下降了很多,分别以葡萄糖和半乳糖为碳源的平板上对不同浓度H202的敏感性实验说明了Δpos5和Δutr1菌株与野生型相比抗氧化能力有了很大的降低,这很可能与胞内NADP(H)的水平下降有关；由此可以推断Δpos5和Δutr1基因缺失菌株由于影响了胞内NADP(H)浓度,造成了GAL基因的转录缺陷。因为胞内各种代谢途径都会受到NADP(H)水平的影响,因而POS5和UTR1基因的缺失对半乳糖代谢的影响是否具有特异性?通过进一步对组成型表达基因ADH1和PMA1的mRNA的检测,结果显示ADH1和PMA1在野生型和Δpos5和Δutr1菌株中均能正常的转录；葡萄糖和半乳糖为碳源的平板生长结果表明,野生型,Δpos5和Δutr1菌株均能正常的在以葡萄糖为碳源的平板生长,而以半乳糖为碳源的平板上Δpos5和Δutr1菌株均不能正常的生长。以上结果表明了POS5和UTR1基因的缺失引起的胞内NADP(H)水平的降低能够特异性的导致GAL基因转录缺陷。4.在ATP合成途径基因和NAD(H)激酶基因缺失菌中过量表达Gal3或与Gal80相互作用改变的Gal4突变体与半乳糖代谢功能的恢复机制的研究在半乳糖正常的代谢过程中,GAL基因的正常调控表达是必须的。GAL基因的诱导表达受转录激活因子Gal4和转录抑制因子Gal80,信号感应蛋白Gal3还有半乳糖,ATP小分子的参与。在半乳糖,ATP小分子的协助下Gal3可以捕获核内的Gal80从而解除对Gal4的抑制作用来实现GAL基因的正常诱导表达。而NADP(H)通过与Gal80的直接结合来去稳定Gal80-Gal4复合物来实现Gal4的解抑制作用,从而激活GAL基因的表达。由此看来Gal4与Gal80这两个蛋白之间的相互作用成为GAL基因的正常调控表达的关键。通过在ATP和NADP(H)合成受影响的基因缺失菌株中过量表达Gal3或是表达与Gal80相互作用减弱的Gal4的突变体看其代谢半乳糖的情况,来探讨这些基因缺失菌株的半乳糖代谢缺陷机制。实验结果显示,过量表达Gal3或是表达与Gal80相互作用减弱的Gal4的突变体均能够回补ATP合成受影响的△rip1,△atp1菌株,和NADP(H)水平降低的Δpos5和Δutr1菌株。从报告基因的水平,GAL1的转录水平以及磷酸化形式的RNA聚合酶在启动子上的占据情况以及在以葡萄糖和半乳糖为碳源的平板上的生长情况来看均能达到野生型菌的情况。说明了过量表达Gal3或是表达与Gal80相互作用减弱的Gal4的突变体均能回补ATP合成受影响的△rip1,△atp1菌株,和NADP(H)水平降低的Δpos5和Δutr1菌株。从以上的实验结果可以推测,胞内的能量和NADP(H)水平可能改变了Gal4-Gal80间的相互作用；而这两种途径的调节作用是否具有协同效应目前还没有研究。因而本部分内容主要探讨胞内的能量水平和NADP(H)对Gal4-Gal80间的相互作用的调节。体外的实验结果显示,ATP,半乳糖和Gal3能够去稳定Gal4-Gal80复合物,而NADP(H)也能够去稳定Gal4-Gal80复合物,而NAD(H)却不能。当ATP,半乳糖和Gal3这条路径去稳定Gal4-Gal80复合物时加入一定浓度的NADP时,能够减小Gal3的用量；同样NADP(H)去稳定Gal4-Gal80复合物时加入一定浓度的ATP,半乳糖和Gal3,也可以减少NADP的用量；当这两条路径同时存在时,检测不同时间去稳定Gal4-Gal80复合物的效果表明两者具有协同性；另一方面在能量合成受影响的JN1-rip1菌株中超标达Pos5时,GAL基因的转录水平和报告基因的活性都有一定程度的恢复,可见胞内的能量和NADP(H)水平能够协同Gal80解离；对细胞能量合成受影响的Sc320-rip1菌株和胞内NADP(H)水平下降的Sc320-pos5菌株中Gal80的CHIP结果表明,在基因缺失菌株中Gal80没有发生解离。可见胞内能量和NADP(H)水平的降低改变了Gal4-Gal80之间的相互作用,从而导致GAL基因转录缺陷；在DSG1缺失菌株中Gal80的CHIP结果发现也没有有效地解离,当其转录水平在兼性厌氧条件下进一步降低时Gal80的解离进一步受到严重影响；另一方面与Gal80相互作用减弱的K23R突变体恢复了功能性mRNA的合成,其Gal80的解离作用也恢复了正常。因而Gal80从Gal4上有效解离不仅决定着GAL基因能否转录,还影响mRNA的加工过程,最终实现对整个转录过程的精细调控。