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第一部分:实验一:目的:下调人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMCs)的Rho激酶Ⅰ/Ⅱ(ROCKⅠ/Ⅱ)基因表达。方法:首先利用siRNA技术分别下调HA-VSMCs的ROCK Ⅰ和ROCK Ⅱ基因,24h后倒置显微镜下观察转染效果,细胞转染48h后将细胞分成6组:空白对照组、ROCKⅠsiRNA 组、ROCKⅡsiRNA 组、TGF-β1 组、ROCKⅠsiRNA+TGF-β1 组、ROCK ⅡsiRNA+TGF-β1 组,空白对照组、ROCK ⅠsiRNA 组、ROCK ⅡsiRNA 组在完全培养基中培养,TGF-β 1 组、ROCK siRNA+TGF-β 1 组、ROCK ⅡsiRNA+TGF-β 1组在含有5ng/mlTGF-β 1的完全培养基中培养,24h后Western blot检测各组ROCK Ⅰ、ROCK Ⅱ蛋白表达水平。结果:与空白对照组相比,TGF-β1组的ROCK Ⅰ蛋白表达明显升高(P<0.05),而ROCK Ⅱ蛋白表达无明显变化(P>0.05);与空白对照组相比,ROCK ⅠsiRNA组、ROCK ⅡsiRNA组HA-VSMCs中相应的靶蛋白ROCK Ⅰ、ROCKⅡ表达明显降低(均 P<0.0 5);与 TGF-β 1 组相比,ROCK ⅠsiRNA+TGF-β 1 组、ROCK ⅡsiRNA+TGF-β 1组HA-VSMCs中相应的靶蛋白ROCK Ⅰ、ROCKⅡ表达明显降低(均P<0.05)。结论:成功构建HA-VSMCs的ROCK ⅠsiRNA和ROCK ⅡsiRNA转染模型。TGF-β 1可诱导HA-VSMCs的ROCK Ⅰ蛋白表达,ROCK ⅠsiRNA转染后可抑制此过程。实验二:目的:探讨ROCK Ⅰ/Ⅱ对TGF-β 1诱导的HA-VSMCs表型转化的影响。方法:将体外培养的HA-VSMCs分成5组:空白对照组、TGF-β1组、ROCKⅠ siRNA +TGF-β 1 组、ROCKⅡ siRNA+TGF-β 1 组、Y-27632+TGF-β 1 组(Y-27632为ROCK Ⅰ的特异性抑制剂);分别进行不同预处理,24h后Western blot及荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测各组细胞收缩型标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌22α(SM22α)、合成型标志蛋白骨桥蛋白(OPN)的蛋白表达量和mRNA含量。结果:与 TGF-β 1 组相比,ROCK Ⅰ siRNA+TGF-β 1 组 α-SMA、SM22 α 的蛋白表达量和mRNA含量均显著增加(P<0.05),而OPN的蛋白表达量和mRNA含量均显著减少(P<0.05);与TGF-β1组相比,ROCKⅡ siRNA+TGF-β 1组上述蛋白表达量和mRNA含量均无显著差异(P>0.05)。结论:TGF-β1可诱导HA-VSMCs由收缩型向合成型表型转化,ROCKⅠ基因在这一转化中起重要作用,而ROCKⅡ基因的作用不明显。实验三:目的:探讨ROCK Ⅰ/Ⅱ对TGF-β 1诱导的HA-VSMCs迁移及增殖的影响。方法:将体外培养的HA-VSMCs分成5组:空白对照组、TGF-β 1组、ROCKⅠ siRNA+TGF-β 1 组、ROCKⅡsiRNA+TGF-β 1 组、Y-27632+TGF-β 1 组,分别进行不同干预处理后,利用Transwell、CCK-8试验检测各组细胞迁移、增殖能力。结果:与空白对照组相比,TGF-β1组细胞迁移数明显增加(P<0.05);与TGF-β 1 组相比,ROCK ⅠsiRNA+TGF-β 1 组、Y-27632+TGF-β 1 组细胞迁移数减少[(6 1.0 ± 1.8)vs.(208.3±18.9);(63.3 ± 7.4)vs.(208.3 ± 18.9),均P<0.05],而ROCK ⅡsiRNA+ TGF-β 1组细胞迁移无明显变化(P>0.05)。与空白对照组相比,TGF-β1 组OD 值升高[(1.350±0.057)vs.(1.252±0.061),P<0.05];与 TGF-β1 组比较,ROCK ⅠsiRNA+TGF-β 1 组、ROCK ⅡsiRNA+TGF-β 1组、Y-27632+TGF-β 1组OD值均无明显变化(均P>0.05)。结论:在TGF-β 1诱导的HA-VSMCs迁移中ROCK Ⅰ起重要作用,而在TGF-β 1诱导的HA-VSMCs增殖中ROCK Ⅰ和ROCK Ⅱ的作用均不明显。第二部分:实验一:目的:探究HA-VSMCs和人主动脉内皮细胞(HA-ECs)共培养对合成胶原蛋白Ⅰ型(COL Ⅰ)和胶原蛋白Ⅲ型(COL Ⅲ)的影响。方法:将体外培养的HA-VSMCs和HA-ECs利用Transwell小室建立VSMC-EC共培养模型,VSMC上室,EC下室,24h后将细胞分为:EC对照组、VSMC对照组、VSMC-EC 共培养组、EC+TGF-β 1 组、VSMC+TGF-β 1 组、VSMC-EC 共培养+TGF-β1组,培养6h、12h、24h以及48 h后利用ELISA检测培养上清中COL Ⅰ和COL Ⅲ的含量。结果:与EC对照组、VSMC对照组相比,VSMC-EC共培养下COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表达量显著升高(P<0.01),与EC+TGF-β 1组、VSMC+TGF-β 1组相比,VSMC-EC共培养+TGF-β 1组COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表达量显著升高(P<0.01),与VSMC-EC共培养组相比,VSMC-EC共培养+TGF-β 1组COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表达量显著升高(P<0.01)。结论:VSMC-EC共培养可显著增加COL Ⅰ和COL Ⅲ的蛋白合成,而TGF-β 1对此过程有显著促进作用。实验二:目的:探究TGF-β 1诱导下人主动脉VSMC-EC共培养对ROCKⅠ和RhoA蛋白合成的影响。方法:将体外培养的HA-VSMCs和HA-ECs分为:VSMC、VSMC+TGF-β 1组、VSMC-EC 共培养组、VSMC-EC 共培养+TGF-β 1 组,24h 后利用 Western blot 检测ROCK Ⅰ和RhoA的蛋白表达量。结果:与VSMC对照组相比,VSMC-EC共培养组ROCKⅠ和RhoA蛋白表达量无明显差异(P>0.05);与 VSMC+TGF-β 1 组相比,VSMC-EC 共培养+TGF-β 1 组 ROCKⅠ和RhoA蛋白表达量无明显差异(P>0.05);与VSMC组相比,VSMC+TGF-β1组ROCKⅠ蛋白表达量明显增加(P<0.05),而RhoA蛋白表达量无明显差异(P>0.05);与VSMC-EC共培养组相比,VSMC-EC共培养+TGF-β 1组ROCKⅠ蛋白表达量显著增加(P<0.0 1),且RhoA蛋白表达量明显增加(P<0.05)。结论:在TGF-β 1作用下有迁移能力的HA-VSMCs与HA-ECs共同培养可促进ROCK Ⅰ和RhoA的蛋白表达。实验三:目的:探究下调HA-VSMCs的ROCK Ⅰ基因表达后与HA-ECs共培养对合成C01Ⅰ、COlⅢ、ROCKⅠ 和 RhoA 蛋白的影响。方法:将体外培养的HA-VSMCs通过siRNA转染下调其ROCK Ⅰ基因,再将转染后的HA-VSMCs和未转染的HA-ECs分成5组:VSMC-EC共培养组、VSMC-EC共培养+TGF-β 1 组、VSMC-EC 共培养+ROCKⅠsiRNA+TGF-β 1 组、VSMC-EC 共培养+siRNA-C+TGF-β 1 组、VSMC-EC 共培养+Y-27632+TGF-β 1 组,24h 后 ELISA 检测不同分组COL Ⅰ和COLⅢ的含量,Western blot检测不同分组ROCK Ⅰ和RhoA蛋白表达量。结果:与VSMC-EC共培养+TGF-β 1组相比,VSMC-EC共培养+ROCKⅠsiRNA+TGF-β 1 组及 VSMC-EC 共培养+Y-27632 +TGF-β 1 组 COL Ⅰ 和 COLⅢ蛋白表达量显著减少(P<0.01);与VSMC-EC共培养+TGF-β 1组相比,VSMC-EC共培养+siRNA-C+TGF-β 1组COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表达量无明显差异(P>0.05),与VSMC-EC共培养组相比,VSMC-EC共培养+TGF-β 1组COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表达量显著增加(P<0.01)。与VSMC-EC共培养+TGF-β1组相比,VSMC-EC共培养+ROCK ⅠsiRNA+TGF-β 1 组、VSMC-EC 共培养+Y-27632+TGF-β 1 组 ROCK Ⅰ 和RhoA蛋白表达量无明显差异(P>0.05);与VSMC-EC共培养+TGF-β1组相比,VSMC-EC共培养+siRNA-C+TGF-β 1组ROCK Ⅰ和RhoA蛋白表达量无明显差异(P>0.05);与VSMC-EC共培养组相比,VSMC-EC共培养+TGF-β 1组ROCK Ⅰ和RhoA蛋白表达量显著增加(P<0.01)。结论:下调HA-VSMCs的ROCK Ⅰ基因可抑制TGF-β 1诱导的VSMC-EC共培养下COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白合成,而对TGF-β 1诱导的VSMC-EC共培养下ROCK Ⅰ和RhoA蛋白表达含量无影响。