一、背景和目的心律失常是常见而严重的应激性疾病,已经成为影响人类健康的重要因素。应激诱发心律失常发生多数情况下是有心脏基础病变存在的,而病变程度不同必然对研究结果产生影响。目前鲜见报道有应激诱发无心脏基础病变动物发生心律失常的模型,亦无其分子机制方面的研究。单因素应激模型适用于研究某一种应激源在应激疾病中的作用,急性应激是以下丘脑-垂体-肾上腺轴反应为主的机体功能变化,而应激疾病的产生往往是多因素作用的慢性过程,慢性应激才可能有心脏电生理变化,因此,有必要建立一种慢性多重应激模型并且可诱导动物心律失常发生,这将为心律失常机制的研究奠定基础。心律失常特别是心房颤动(房颤)严重危害人类健康,机制尚不明了,有多种学说,其中心房电重构是研究的热点之一。电生理重构主要表现为心房肌动作电位有效不应期缩短,电重构的基础即离子通道的分子重构。动作电位是心肌细胞的基本电活动,L-型钙通道电流(ICa,L)是心肌细胞动作电位平台期的主要内向电流,L-型钙通道电流的改变可影响动作电位和平台期电位水平,L-型钙通道开放时间异常具有潜在的致心律失常作用。瞬间外向钾电流(Ito)是在动作电位早期出现的外向钾电流,其特点是对电压依赖的快速激活和灭活。该电流的大小对动作电位的形态和时程有较大影响,是引起心肌复极化的重要钾电流之一。因此,探讨ICa,L和Ito的变化对于研究心律失常心房电重构有重要意义。心房电重构时L-型钙通道蛋白表达变化是通道电流变化的分子基础,电压依赖性钾通道表达变化也参与重构,但对L-型钙通道表达降低与否存在争议。因此深入研究心律失常时心房肌L-型钙通道和钾通道表达变化有重大意义。心肌L-型钙通道和钾通道都有多个亚单位,各亚基发挥着不同的作用。在心律失常心房电重构时各亚单位表达变化值得深入研究。本研究建立大鼠慢性多重应激模型,分析心脏自律性和心房肌细胞内钙浓度变化,探讨L-钙通道电流和瞬间外向钾电流的重构特点,并深入研究L-钙通道和钾通道各亚单位表达变化趋势。用L-钙通道阻滞剂维拉帕米干预,分析维拉帕米对应激性心律失常、钙超载、电重构和通道表达变化的抑制作用。二、内容和方法1.大鼠慢性多重应激模型建立和应激致大鼠心律失常的研究1)用噪声、足底电击、强迫游泳、束缚以及夜间光照的复合刺激建立应激模型。维拉帕米干预应激刺激。观察应激动物行为变化,测量心率、血压和食物利用率。采用高效液相色谱法测定血清NE和Epi浓度,放射免疫法测定血清ACTH和Cor浓度。2)记录心电图,分析心律失常事件。用激光共聚焦显微镜法测定心房肌细胞内钙离子浓度。2.慢性多重应激性大鼠心房肌电生理重构研究1)慢性多重应激大鼠单个心房肌细胞的分离。2)二步拉制法制作膜片钳微电极,充灌电极液。3)形成全细胞膜片钳记录模式。4)记录L-型钙通道电流(ICa,L)和瞬时外向钾通道电流(Ito)。用clampfit软件制作I-V曲线。稳态激活曲线由I-V曲线得到。稳态失活曲线Boltzmann方程拟合。3.慢性多重应激大鼠心房肌L-钙通道和钾通道亚单位基因和蛋白表达变化研究1) real time PCR方法测定L-型钙通道α1c、α2/δ1、β1、β2、β3亚基和钾通道Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3亚单位基因表达。2) L-型钙通道α1c、α2/δ1、β1亚单位和钾通道Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3亚基蛋白表达变化(Western blot方法)。三、结果1.慢性多重应激大鼠心率、血压、食物利用和血清激素的变化慢性多重应激致大鼠心率明显增加,到脱离应激源仍维持在(508±18) b/min,应激+维拉帕米组出现相似的变化趋势,幅度较应激组小。应激组大鼠血压在2w内由(115±15)mmHg升高至(156±26)mmHg,应激4w为(151±22)mmHg,与应激前相比明显增高( P<0.05),应激+维拉帕米组血压渐进性升高,到应激结束达到(137±14)mmHg,高于对照组( P < 0.05)。应激组和应激+维拉帕米组大鼠体重增长均较对照组慢,食物利用率低于对照组( P < 0.05)。应激组动物血清NE、Epi、ACTH和Cor均明显增高。2.慢性多重应激大鼠心律变化应激组大鼠出现多种心律紊乱:窦性心动过速、窦性心律不齐、房性期前收缩、室性期前收缩、阵发性室速、室上速。应激+维拉帕米组大鼠出现心律失常的时间较应激组明显延后(P < 0.05),且心律失常次数较应激+维拉帕米组少(VPB:应激组2.1±0.3 vs应激+维拉帕米组0.7±0.06, P < 0.01 events/min,APB:应激组1.8±0.4 vs应激+维拉帕米组0.2±0.04 events/min, P < 0.01)。3.慢性多重应激大鼠心房肌细胞内钙浓度变化应激组心房肌细胞钙离子浓度高于应激+维拉帕米组和对照组(应激组: 215±26nmol/L vs应激+维拉帕米组: 101±15nmol/L;和对照组: 65±11P < 0.01,P < 0.01)。4.慢性多重应激大鼠心房肌细胞ICa,L和Ito的变化应激组心房肌细胞ICa,L峰电流幅值pA/pF低于维拉帕米组和对照组(A组:-3.71±0.38,B组:-8.46±0.56,C组:-8.90±0.68;A vs B and C, P < 0.01, B vs C, P<0.01)。应激组半数最大激活电位(V1/2)明显高于应激+维拉帕米组和对照组(A组:4.23±0.33mV,B组:-10.09±1.97mV,C组:-13.17±2.44mV;A vs B and C, P < 0.01, B vs C, P>0.05)。应激组稳态失活曲线左移,半数最大失活膜电位(V1/2)较之于对照组和应激+维拉帕米组明显降低(A组:-25.35±2.55mV;B组:-9.19±1.76mV;C组:-0.77±0.14mV:A vs B and C P < 0.01)。应激组Ito峰电流幅度和峰电流密度比应激+维拉帕米组和对照组明显减小(pA/pF: A组: 13.18±4.56mV;B组: 20.64±7.53mV;C组: 25.31±7.58mV:A vs B and C P < 0.01)。5.慢性多重应激大鼠心房肌L-钙通道和钾通道表达变化应激组和应激+维拉帕米组L-型钙通道α1c、α2/δ1、β1、β2、β3亚单位的mRNA表达水平低于对照组(P<0.01),应激组β1和β2亚基mRNA表达水平低于维应激+拉帕米组(分别为P<0.05和P<0.01 )。应激组和对照组钾通道Kv1.4,Kv4.2,Kv4.3亚单位的mRNA表达水平低于应激+维拉帕米组(P<0.01),应激组和对照组各亚基mRNA表达水平无统计学差异。应激组L-型钙通道α1c、α2/δ1、β1亚基和钾通道Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3亚基蛋白表达明显低于对照组(P<0.01)。应激+维拉帕米组钙通道α1c、α2/δ1、β1亚基和钾通道Kv1.4、Kv4.2亚基蛋白表达明显低于对照组(P<0.01),应激+维拉帕米组钾通道Kv4.3亚基蛋白表达低于对照组(P<0.05)。应激组L-型钙通道α1c、β1亚基和钾通道Kv1.4亚基蛋白表达明显低于应激+维拉帕米组(分别为P<0.01, P<0.05, P<0.05)。四、结论1.成功建立了大鼠慢性多重应激模型,应激大鼠出现房性期前收缩和室性期前收缩等多种心律紊乱,一般行为发生了变化,心率增快,血压升高。2.慢性多重应激大鼠心房肌细胞钙稳态失衡,细胞内钙超载。心房肌发生电生理重构,表现为心房肌细胞L-型钙通道电流(ICa,L)和瞬间外向钾通道电流(Ito)下调,L-型钙通道激活电位升高,失活电位降低。心房肌细胞内钙超载和心房肌电生理重构可能是慢性多重应激诱导的心律紊乱的分子基础。3.慢性多重应激大鼠心房肌L-型钙通道α1c、α2/δ1、β1亚基和钾通道Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3亚单位基因和蛋白表达降低,分别是心房肌ICa,L和Ito降低的分子基础。提示L-型钙通道和钾通道表达降低可能是心房肌电生理重构的重要分子机制。4.预用维拉帕米可抑制慢性多重应激诱导的心率增快、拮抗心房肌细胞内钙超载、抑制应激诱导的心房肌电生理重构,并在一定程度上减轻了应激诱导的大鼠心房肌L-型钙通道和钾通道表达降低。维拉帕米对慢性多重应激诱导的心律紊乱有一定的防治作用。