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目的建立ARPE-19细胞缺氧模型,探讨缺氧条件下视网膜色素上皮细胞(retina pigment epithelium, RPE) MEK/ERK信号传导通路与细胞问紧密连接蛋白的改变,以及影响紧密连接的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的变化。方法ARPE-19细胞复苏后取对数生长期细胞,利用化学制剂二氯化钴(CoCl2)诱导其缺氧模型。将细胞培养于60×15mm细胞培养皿中,取6份细胞随机均分为缺氧组和正常对照组,缺氧组培养基中加入浓度为200μM的二氯化钻(CoCl2),而正常对照组中加入等量的二甲基亚砜(DMSO)。3小时后利用Western Blot检测各组细胞中缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1a, HIF-1α)以明确细胞缺氧情况,之后以Western Blot检测在缺氧环境下ARPE细胞中p-ERK/t-ERK的随时间变化曲线(每间隔0.5小时检测一次,共3小时),24小时检测细胞间紧密连接蛋白之一的密封蛋白(occludin)的变化,并于3,6,12,24小时利用ELISA检测细胞培养液中细胞分泌的VEGF的时间变化曲线。结果CoCl2诱导的缺氧条件下,3小时检测HIF-1α明显增高,为正常对照组的1.57倍,差异有统计学意义(p<0.001)。缺氧条件下ARPE-19细胞中p-ERK蛋白表达量随时问推移,自1.5小时起较正常组逐渐增多,约于2.5小时时达到顶峰,随后逐渐回落,与正常组蛋白表达量相比,缺氧情况下高峰时p-ERK蛋白表达量增加了约4.12倍(p<0.001)。而t-ERK在缺氧及正常情况下总量不变(p>0.05)。缺氧组细胞问occludin蛋白的表达量较正常组减少了53.3%,差异有统计学意义(p<0.001)。分别在3,6,12,24小时时检测到缺氧组与正常对照组培养液中VEGF含量(pg/m1)分别为：574.21±27.60vs572.21±49.66；939.34±58.79vs642.84±23.98,；1294.62±11.15vs952.69±29.41；1820.31±49.68vs1587.15±54.57,统计学分析表明3小时前缺氧组与正常组VEGF的表达无统计学差异(p>0.05)；6,12,24小时缺氧组VEGF表达均较正常组增多,差异有统计学意义(p<0.01)。结论CoCl2诱导APRE-19细胞的缺氧模型是成功的。缺氧条件下,ARPE-19细胞中的MEK/ERK信号传导通路被激活,密封蛋白occludin被破坏,而VEGF的表达增多。目的探讨阻断缺氧条件下ARPE-19细胞中MEK/ERK信号传导通路的激活对VEGF分泌的影响及细胞间紧密连接蛋白的保护作用。方法按第一章所述方法将同一批对数生长期ARPE-19细胞共12份,随机均分为缺氧组和正常组,两组中又分为MEK抑制剂PD98059干预组和DMSO对照组,分别于培养液中加入浓度为20μM的PD98059及等量DMSO预干预1小时,每组重复3份。沿用上一章中各时间点,以VVestern bolt检测各组细胞表达的p-ERK/t-ERK以确定PD98059对ARPE-19细胞中MEK/ERK信号通路的阻止作用,之后运用WesternBlot检测细胞中HIF-1α, occludin表达,及ELISA检测培养液中VEGF,对比阻断MEK/ERK信号通路前后这些蛋白的变化情况。最后采用20,30,40μM三种浓度的PD98059对剂量依赖性进行检测。结果CoCl2干预2.5小时检测p-ERK表达峰值发现,缺氧组中20μM PD98059干预后的p-ERK的表达较无PD98059干预组减少约52.06%,差异有统计学意义(p<0.001)；而正常组中PD98059干预后p-ERK的含量与无干预组问无统计学差异(p>0.05)。CoCl2干预3小时检测HIF-1α,缺氧组PD98059干预前后HIF-1α的分别为正常对照组的1.57倍及1.52倍,两组间无统计学差异(p>0.05)。ELISA检测3,6,12,26小时VEGF含量表明,缺氧组中自6小时起各时间点PD98059干预组VEGF表达较无PD98059干预组下降,差异有统计学意义(p<0.001),而正常组PD98059干预前后VEGF表达无统计学差异(p>0.05)。24小时检测occludin的含量,缺氧组中PD98059干预后其含量明显升高,由无干预时DMSO对照组的46.7%(p<0.001)上升到80.3%(p<0.005)。剂量依赖实验表明,当PD98059剂量由20gM提高到30μM时,其对缺氧组p-ERK的抑制效率由60.1%提高到94.8%,同时occludin的表达量由DMSO组的80.1%提高到99.0%,差异有统计学意义(p<0.001),40μM与30μMPD98059对p-ERK及occludin的影响比较,差异无统计学意义(p>0.05)。递增PD98059浓度后对缺氧组的VEGF含量的抑制差异无统计学差异(p>0.05)。结论阻断缺氧环境下ARPE-19细胞中MEK/ERK信号传导通路后,对HIF-1α的升高无影响,但使VEGF的分泌显著下降,降低了细胞间紧密连接蛋白occludin的破坏,并且对occludin的保护与对MEK/ERK信号通路的阻断具有相平行的剂量依赖性。目的将体外实验结果进一步于体内实验中证实,利用缺氧诱导的视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)小鼠模型,观察阻断MEK/ERK信号传导通路后对缺氧诱导的外层血-视网膜屏障渗漏的保护作用。方法将18只新生小鼠随机分为3组,即OIR组,OIR+PD98059组及正常对照组。OIR组于第7天(P7)至第12天(P12)放置于氧气浓度为75%的氧舱内,之后自氧舱中取出置于室内普通环境下至出生后第17天(P17),OIR+PD98059组于取OIR小鼠于P13至P17腹膜下注射PD98059,正常对照组于P13至P17腹膜下注射等剂量的DMSO。采用Western blot分别检测P13-P17各组小鼠RPE层中t-ERK/p-ERK, HIF-1α,VEGF及occludin蛋白表达,免疫荧光化学检测各组RPE铺片中occludin蛋白的分布情况,FITC-Dextran检测OIR小鼠外层血-视网膜屏障(oBRB)的渗漏以及阻断MEK/ERK信号传导通路后对oBRB渗漏的保护作用。结果OIR小鼠P13-P17的HIF-1α,p-ERK及VEGF蛋白的表达均较正常小鼠升高,分别于P13,P14,P15达到高峰。以表达高峰时各蛋白的表达做统计学分析,三种蛋白分别升高了2.26倍,1.99倍及1.78倍,差异有统计学意义(p<0.001),而P17检测occludin蛋白的表达,OIR组减少,仅为正常组的36.2%,差异有统计学意义(p<0.001),免疫荧光化学显示正常小鼠上RPE较强且边界清晰完整的occludin免疫荧光反应,OIR小鼠细胞问occludin免疫荧光反应不仅在强度上减弱,并且边界变得模糊且有多处缺损。腹膜下注射PD98059后,取各蛋白表达高峰时间点各蛋白的表达做统计学分析,p-ERK及VEGF表达较OIR组分别下降49.4%及35.4%(p<0.001),且与正常组问比较差异无统计学差异(p>0.05),而HIF-1α的表达为正常组的2.12倍,与OIR组问无统计学差异(p>0.05)。检测P17时该组Occludin蛋白,较OIR组有明显升高,上升幅度为35.5%,两组问差异有统计学意义(p<0.005),且免疫组织化学检测occludin免疫荧光反应强度增强,且少有缺损。利用FITC-Dextran检测OIR组及OIR+PD98059组小鼠外层血-视网膜屏障的渗漏情况,腹膜下注射PD98059的OIR小鼠,oBRB的渗漏点较OIR组明显减少,渗漏点数值为3.64±2.04vs10.06±2.91,下降了73.4%,两组问差异有统计学意义(p<0.005)。结论体内实验证实,腹膜下注射PD98059后有效的阻断小鼠缺氧条件下RPE层中MEK/ERK信号传导通路的激活,同时VEGF的分泌被抑制,减少了occludin蛋白的破坏以及oBRB的渗漏,但对HIF-1α的升高无影响。