目的：原发性肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国男性的第二大死亡原因、女性的第五大死亡原因。在世界范围内每年的发病人数约为50万人,其中绝大多数病例出现在发展中国家,尤其是中国、东亚和非洲国家的发病率最高。肝纤维化是肝脏组织发生持续损伤,从而造成组织发生反复修复反应时,细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成降解以及沉积不平衡而引起的病理过程,是慢性肝病的主要病理特征,也是进一步向肝硬化发展的主要环节。肝纤维化与肝癌的发生有着密切的关系。肝纤维化发展到晚期即为肝硬化。在我国,肝癌病人80%以上合并有不同程度的肝硬化。在肝硬化中发生肝癌者15%-25%,一般为20%左右,大多数肝癌是在肝炎后肝硬化基础上发生的。NF2基因是神经纤维瘤病Ⅱ型(neurofibromatosis type2, NF2)的一个关键基因,在很多脑瘤中表达缺失。NF2基因编码的Merlin蛋白属于蛋白4.1超家族成员之一。Merlin是连接细胞膜和皮层细胞骨架的主要分子,它一端结合骨架分子,另一端则和细胞膜的许多受体分子结合；因此,通过这些固定和调节作用,可以精细的调控受体分子复合物在细胞膜上的丰度和分布。Merlin可以控制细胞膜表面可以利用表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的数量。在生长很密集,相互接触的培养细胞中Merlin可以阻止已经和配体结合的EGFR的内化作用,使EGFR信号通路不能持续激活,即表现为接触性抑制。而在缺失Merlin表达的哺乳动物细胞中,即使细胞密度很高,也可以检测到EGFR内化作用以及EGFR通路的持续激活,即表现为接触性抑制的丧失。Merlin和HCC的发生具有密切的关系。在最近的研究中,基因剔除小鼠动物模型的建立,证明了Merlin/NF2基因蛋白在HCC的发生中具有关键的抑制作用。NF2(-/-)完全敲除的小鼠胚胎不能成活,说明NF2基因是小鼠胚胎发育过程中所必需的。NF2(+/-)杂合型基因小鼠,即杂合性缺失NF2基因,有自发成瘤,并具有很高的肿瘤转移率。其中,骨肉瘤发生率极高(63%),其次是肝细胞癌(11%)。近期研究显示,在肝脏特异性NF2(-/-)基因敲除鼠中,在发育的基因剔除小鼠会发生肝祖细胞(即肝卵圆细胞,OCs)过度增生,并最终基本全部发生肝细胞性肝癌(HCC)和胆管细胞癌(CC),且转移到肺。在成年小鼠中特异性敲除肝脏NF2(-/-)基因,肝脏的OCs细胞仅有轻度增殖,并且基本不发生HCC；而对这些小鼠肝脏刺激后,比如实行肝叶部分切除后(PHx) OCs细胞增殖明显,并诱发HCC和CC。对NF2(-/-)小鼠使用EGFR抑制剂Erlotinib,可以明显抑制OCs的增殖。Merlin在肝癌的发生发展中,被认为是一个很强的抑制因素。Merlin对于肝纤维化发生的影响至今尚无人研究。而在我国,肝炎后肝硬化的肝癌发生率很高。那么Merlin是否可以抑制肝纤维化的发生?Merlin是通过何种机制抑制肝纤维化的?因此深入研究了解Merlin对肝癌和肝纤维化的影响关系,对于肝癌、肝纤维化的发生发展机制,以及肝癌的防治方面,都提出了新的指导和新的思路。方法：我们利用qPCR和Western blot方法检测四种肝癌细胞系：FOCUS、MHCC-97H、HepG2、SMMC-7721以及人正常肝细胞株L-02中TGF-β1的表达情况。采用非接触式共培养技术(Transwell小室共培养)共培养FOCUS细胞和肝星状细胞系LX-2细胞。荧光光定量PCR和Western blot检测肝细胞是否对肝星状细胞有激活刺激作用。利用Western blot方法检测了四种肝癌细胞系：FOCUS、MHCC-97H、 HepG2、SMMC-7721以及人正常肝细胞株L-02中Merlin以及TGF-β1的表达情况。利用瞬时转染、Western blot方法研究Merlin对肝癌细胞株TGF-β1表达的影响,以及Merlin对EGFR的影响；以及对肝星状细胞TGF-β/Smad信号通路和ECM合成的影响。结果：利用qPCR和Western blot方法检测四种肝癌细胞系：FOCUS、MHCC-97H、HepG2、SMMC-7721以及人正常肝细胞株L-02中TGF-β1的表达情况。结果显示：FOCUS细胞中TGF-β1的表达水平很高,其次为MHCC-97H,再次为SMMC-7721, HepG2最低；但是在人正常肝细胞株L-02中无论在mRNA还是在蛋白水平都很难检测到TGF-β1的表达。通过免疫组织化学检测了20例肝癌组织标本以及10例正常肝组织中TGF-β1的表达水平。在肝细胞癌组织中TGF-β1强阳性率为55%(11例),弱阳性率为40%(8例),阴性表达1例。在肝细胞癌组织中,TGF-β1表达于癌细胞胞浆以及癌组织的间质中。而在所有的正常肝组织中,正常肝细胞都没有检测到TGF-β1的表达,而在肝组织的内皮细胞中可以检测到TGF-β1的强阳性表达。这些结果证明了TGF-β1在肝细胞癌中表达水平明显增高,肝癌细胞可以自身分泌TGF-β1。采用非接触式共培养技术(Transwell小室共培养)共培养FOCUS细胞和肝星状细胞系LX-2细胞。荧光光定量PCR和Western blot证实：肝癌细胞FOCUS可以分泌TGF-β1,激活LX-2细胞的TGF-β1/Smad通路,促进LX-2细胞合成细胞外基质(ECM)。利用Western blot方法检测了四种肝癌细胞系：FOCUS、MHCC-97H、 HepG2、SMMC-7721以及人正常肝细胞株L-02中Merlin以及TGF-β1的表达情况。两者表达情况呈相反的趋势,即Merlin表达高的细胞株中TGF-β1的表达低甚至缺失,而Merlin表达缺失的细胞株中TGF-β1的表达则很高。在相同的细胞密度下,分别转染pCDNA-NF2质粒和pCDNA3.1(+)空质粒。在转染处理组中,随着pCDNA-NF2质粒量的依次增加,Merlin的表达依次增加,而TGF-β1表达量则随着Merlin表达的依次增加而逐渐减弱；空载体组中Merlin表达均缺失,TGF-β1表达水平基本一致。这说明Merlin调控了TGF-β1的表达,恢复Merlin的表达可以减低TGF-β1的表达水平。在相同的细胞密度下,分别转染不同浓度的pCDNA-NF2质粒和pCDNA3.1(+)空质粒至FOCUS细胞。将转染了各质粒的FOCUS细胞与LX-2细胞进行共培养。我们发现随着上室FOCUS细胞中Merlin的表达水平依次增高,下腔LX-2细胞TGF-β1/Smad通路激活依次减弱,如p-Smad2, p-Smad3依次减弱；同时合成细胞外基质(ECM)依次减弱,即Fibronectin, Collagen Ⅰ, Collagen Ⅲ表达依次减弱。这说明在FOCUS细胞中恢复Merlin表达可以减少TGF-β1的表达,而使肝星状细胞合成ECM减少,从而抑制了肝纤维化的发生。同时Merlin高表达的转染组可以明显抑制表皮生长因子受体(EGFR)的激活,从而抑制TGF-β1的表达；而空载体对照组在EGF刺激后,表皮生长因子受体(EGFR)被激活,TGF-β1的表达随EGF的浓度依次明显增高。结果证实了Merlin可以抑制表皮生长因子受体信号通路,从而下调TGF-β1的表达分泌。随着肝星状细胞LX-2细胞数目的依次增多,Merlin表达依次增高。在这种线性细胞密度下,在TGF-β1刺激下,LX-2细胞TGFBR Ⅰ型受体、Smad2磷酸水平依次减低,TGF-β/Smad信号通路受到抑制；而在同样的条件下,由于肝细胞癌细胞FOCUS缺失Merlin表达,无论细胞数目的多少FOCUS细胞都不表达Merlin。在线性细胞密度下,使用TGF-β1刺激,FOCUS细胞的TGF-β/Smad信号通路始终保持持续激活状态。在肝星状细胞LX-2细胞中,低细胞密度下Merlin表达低；高细胞密度下Merlin表达高。在这两种细胞密度下,使用TGF-β1刺激,低细胞密度的LX-2细胞与高密度的情况相比TGF-β/Smad信号通路被显著激活；其合成ECM能力也大大增加。同时我们在低细胞密度的情况下,转染NF2的真核表达载体,提高Merlin的表达水平,再使用TGF-β1刺激,其TGF-β/Smad信号通路明显受到抑制；ECM合成受到明显抑制。另一方面,在高细胞密度的情况下,转染NF2的shRNA干扰载体,降低Merlin的表达水平,再使用TGF-β1刺激,其TGF-β/Smad信号通路抑制作用解除；ECM合成增加。结论：综上所述,本研究通过检测各肝癌细胞株以及肝细胞癌患者中的TGF-β1蛋白表达水平,明确了在一些肝癌细胞株中以及肝癌患者中TGF-β1蛋白表达上调；肝癌细胞可以自身分泌TGF-β1,激活肝星状细胞的TGF-β1/Smad通路,促进肝星状细胞合成细胞外基质,促进肝纤维化的发生。Merlin可以抑制表皮生长因子受体信号通路,从而下调TGF-β1的表达分泌。在肝癌细胞中恢复Merlin表达可以减少TGF-β1的表达,而使肝星状细胞合成ECM减少,从而抑制了肝纤维化的发生。同时,Merlin也可以负调控TGF-β/Smad信号通路,从而抑制肝纤维化。