论文部分内容阅读
第一部分 采用 RNA 干扰技术抑制哺乳动物细胞绿色荧光蛋白的表达目的:本研究旨在探讨阳离子脂质体的体外转染效率、化学合成双链 RNA(dsRNA)诱导 RNA 干扰(RNAi)的效应强度及其作用特点,为采用 RNAi技术开展基因治疗提供实验依据。方法:(1)采用磷酸钙沉淀法构建 293T/GFP 细胞株。(2)体外化学合成 dsRNA,经 由 三 种 不 同 的 阳 离 子 脂 质 体 TransIT-TKO, Oligofectamine reagent,Lipofectamine 2000 导入 293T/GFP 细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪测定荧光强度的变化,观察不同阳离子脂质体的体外转染效率。(3)采用 dsRNA-Lipofectamine 2000复合物转染293T/GFP细胞。dsRNA分设5个不同的浓度(0.01,0.02, 0.04, 0.08, 0.16μmol/L)转染细胞 48 h 以观察剂量效应关系。dsRNA0.08μmol/L/ Lipofectamine2000 8μl 转染细胞,于 4 个不同的时间点(12 h, 24h,48 h,72 h)观察时间效应关系。结果:绿色荧光蛋白序列特异性 dsRNA(dsRNA-eGFP)经由三种不同的阳离子脂质体导入细胞均可产生 RNAi 效应,序列非特异性 dsRNA(dsRNA-unrelated)无抑制效应。在三种不同的阳离子脂质体中,Lipofectamine2000 的转染效率最强,转染 48 h 可将 293T/GFP 细胞荧光强度降低约 80%,与空白载体组比较差异显著,TransIT-TKO 组, Oligofectamine reagent 组分别降低 41.02%、37.45%,与空白载体组比较无显著差异,而且 TransIT-TKO、Oligofectamine 的细胞毒性较强。结果还表明 dsRNA/ Lipofectamine 2000 诱导的 RNAi 效应具有剂量及时间双重依赖性,dsRNA 0.08μmol/L/ Lipofectamine 2000 8μl/6 孔培养板转染细胞 48 h 的抑制效应最强。结论:(1)体外化学合成的 dsRNA 可有效诱导哺乳动物细胞出现序列特异性基因沉默效应。(2)三种不同的阳离子脂质体中 Lipofectamine 2000 的转染效率最强,且细胞毒性轻微。(3)dsRNA/ Lipofectamine 2000 诱导的 RNAi 效应具有剂量及时间双重依赖性。关键词:RNA 干扰; 双链 RNA;绿色荧光蛋白第二部分 RNA 干扰技术抑制非小细胞肺癌表皮生长因子受体的表达目的: 探讨采用化学合成小干扰 RNA(siRNA)介导的 RNA 干扰(RNAi)技术是否能有效抑制非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株 A549、SPC-A1 细胞表皮生长因子受体(EGFR)表达,以及抑制 EGFR 基因表达后 NSCLC 细胞生物学特性的改变,以 1<WP=5>期为肿瘤治疗提供新的思路和实验依据。方法:(1)建立检测 EGFR 数量的方法,测定 A549、SPC-A1 细胞株 EGFR 的表达。(2)体外化学合成 EGFR 序列特异性双链 RNA(dsRNA-EGFR),与 Lipofectamine2000 结合后转染细胞,采用荧光显微镜、Western blot 技术和流式细胞仪检测EGFR 表达,采用 Real-timePCR 检测 EGFR 基因水平,观察 dsRNA-EGFR/Lipofectamine 2000 对 EGFR 表达的抑制作用。(3)采用流式细胞仪测定细胞周期,采用 ELISA 法测定配体 EGF 含量,结合细胞计数、集落形成、刮痕实验、化疗敏感性分析观察抑制 EGFR 表达后,A549、SPC-A1 细胞生物学特性的改变。结果:A549、SPC-A1 细胞株存在 EGFR 高表达。dsRNA-EGFR/Lipofectamine 2000复合物转染细胞可引发 EGFR 序列特异性基因沉默效应,荧光显微镜下观察、流式细胞仪检测、Western Blot 分析得到了一致的结果。对于 A549 细胞,与对照组比较,dsRNA-EGFR 组 EGFR 基因及蛋白水平分别下调了 37.04%、71.31%,细胞生长抑制了 85.0%,集落形成抑制了 63.3%,细胞迁移能力明显降低。细胞周期分析结果表明 dsRNA-EGFR 组 G0-G1期细胞百分数较对照组增加了 12.67%,进入 S期的细胞百分数较对照组减少了 6.56%。转染 dsRNA-EGFR 后可将 A549 细胞对顺铂的敏感性提高约 4 倍。ELISA 结果表明 dsRNA-EGFR 组培养液及细胞抽提蛋白中的 EGF 分别降低了 27.74%、11.07%;对于 SPC-A1 细胞,与对照组比较,dsRNA-EGFR 组 EGFR 基因及蛋白水平分别下调了 50.00%、71.78%,细胞生长抑制了 78.3%,集落形成抑制了 66.8%,细胞迁移能力明显降低。细胞周期分析结果表明 dsRNA-EGFR 组 G0-G1期细胞百分数较对照组增加了 17.48%,进入 S 期的细胞百分数较对照组减少了 19.20%。转染 dsRNA-EGFR 后可将 SPC-A1 细胞对顺铂的敏感性提高约 7 倍。ELISA 结果表明 dsRNA-EGFR 组培养液及细胞抽提蛋白中的 EGF 分别降低了 45.65%、22.45%。结论:(1)NSCLC 细胞株存在 EGFR 高表达。(2)dsRNA-EGFR 可序列特异性下调NSCLC 细胞 EGFR 基因水平,显著降低 EGFR 蛋白表达。(3)dsRNA-EGFR 通过抑制EGFR 表达可显著抑制细胞增生和细胞迁移,降低配体 EGF 的含量,将更多的细胞阻滞在 G0-G1期,增加细胞对顺铂的敏感性,有效逆转 NSCLC 细胞的恶性表型,从而为 NSCLC 基因治疗提供了新策略。关键词:表皮生长因子受体;RNA 干扰;小干扰 RNA;双链 RNA;非小细胞肺癌第三部分 RNA 干扰技术抑制 NSCLC 细胞 EGFR 表达的在体实验研究目的:探讨采用体外化学合成的小干扰 RNA(siRNA)结合阳离子脂质体是否能有效在体转染 NSCLC 细胞,以期为 RNAi 的在体实验研究提供