第一部分热疗用磁性纳米基因载体PEI-Mn0.5Zn0.5Fe2O4的制备及表征　　 目的:①研究肿瘤热疗用Mn0.5Zn0.5Fe2O4(MZF)磁性纳米粒子的制备及表征。②研究PEI对磁性Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒的表面修饰及特性检测，生物相容性评价及其作为基因载体的可行性研究。　　 方法:①采用改良的化学共沉淀法制备Mn0.5Zn0.5Fe2O4(MZF)磁性纳米粒子。运用高分辨电镜(High Resolution Electron Microscopy, HREM)， X射线衍射分析(x-raydiffraction，XRD)，能谱仪(energy dispersive spectrometer, EDS)对纳米粒的形貌，结构及成分进行分析，并在高频交变磁场(AMF)下检测MZF磁流体的体外升温情况。②MTT实验评价修饰前后的纳米材料的细胞毒性;溶血试验评价其有无溶血作用;小鼠腹腔注射材料混悬液以测定其LD50;微核试验评价其有无致畸、致突变作用。③采用聚乙烯亚胺(PEI)对MZF进行表面修饰，傅立叶红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)检测表面的官能团变化，并在高频交变磁场(AMF)下检测PEI-MZF磁流体的升温效果。④琼脂糖凝胶电泳检测PEI-MZF与DNA的结合情况。　　 结果:①Mn0.5Zn0.5Fe2O4磁性纳米粒的表征:HREM图显示MZF磁性纳米粒大小较均匀、电子密度高，粒径在30nm-40nm之间;EDS证实制备的MZF纳米粒中含有Mn，Zn，Fe与O四种元素，且Mn，Zn，Fe的摩尔比约为1∶1∶4;XRD表明制备的MZF各个衍射峰所对应的面间距（d值）与粉末衍射标准联合会(JCPDS)编制的代表物质为尖晶石型磁性的PDF（Powder Diffraction File）卡片d值吻合一致。体外升温试验，AMF作用下不同浓度的MZF纳米磁流体均能升温到39℃～50℃，且加热40min后温度基本保持恒定。②MZF磁性纳米粒的浸提液对L-929细胞细胞相容的毒性0～1级，无毒性;无溶血发生;LD50为3.392g/kg，95％的可信区间为1.245～9.243g/kg，具有较广的安全值范围;微核试验证实该材料无致畸或致突变作用。③修饰后的PEI-MZF的表征:FTIR显示修饰后粒子的红外光谱图出现了—NH2和—CH2—的特征小峰，证明了PEI在颗粒表面能够产生吸附。体外升温实验显示，10mg/mL的MZF磁性纳米粒和PEI-MZF复合纳米粒的磁流体在相同强度的AMF作用下，升温能力相同，可用于热疗。④琼脂糖凝胶电泳示PEI-MZF与DNA二者质量比为20时结合情况良好。　　 结论:①应用化学共沉淀法己成功制备了Mn0.5Zn0.5Fe2O4磁性纳米粒且PEI成功地包覆于MZF的表面。②修饰前后的复合纳米粒均具有良好的磁响应性，吸收磁能而升温的能力，及作为基因载体的可行性，可以进一步用于肿瘤的联合治疗。　　 第二部分辐射/热激双启动子介导的抗肿瘤基因(pEgr1-Hsp70-HSV-TK)真核表达质粒的构建、鉴定及其在细胞内的诱导表达　　 目的:构建用于基因治疗的辐射/热激双启动子抗肿瘤基因(Egr1-pHsp70-HSV-TK)重组真核表达质粒，并体外转染HEK293细胞，观察在辐射、热激或二者共同诱导后HSV-TK基因的表达情况。　　 方法:①以真核表达质粒pIRES-CMVE-Egr1p为模板，PCR扩增得到CMVE-Egr1片段，然后将其亚克隆至pCDNA3.1-EGFP质粒上，构建辐射诱导的pCDNA3.1-Egr1-EGFP真核表达质粒。②以pD3SX-Hsp70-HSVTK质粒为模板，PCR扩增得到HSV-TK片段，将其构建至pCDNA3.1-Egr1-EGFP中，取代EGFP，得到pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSVTK质粒。③同样以pD3SX-Hsp70-HSVTK质粒为模板，PCR扩增得到Hsp70片段，将其构建至1步所得的质粒中，得到pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-EGFP双启动子质粒。④将Hsp70片段亚克隆至pCDNA3.1-Egr1-HSV-TK上，构建辐射、热激双启动子pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSVTK质粒。⑤每个构建步骤后均需挑取阳性克隆，测序鉴定后进行下一步的构建。最后大量抽提质粒。⑥磁性转染法将pCDNA3.1-Egr1-HSVTK基因导入HEK293细胞，2GyX线照射1h、6h、12h、24h和48h后， Real-time PCR法检测TK基因表达量的差异。HEK293细胞经1Gy，2Gy，4Gy，8Gy，16Gy不同剂量X射线照射，6h后收集各组细胞，与未处理组比较，观察射线照射对TK基因表达量的影响。同样转染方法将双启动子质粒导入HEK293细胞，比较经2Gy X线照射联合磁热疗，单纯辐射，单纯磁热疗处理6h后，各组与不诱导组的TK基因表达量的差异。⑦磁性转染法将双启动子的HSV-TK质粒导入HEK293，辐射、加热诱导后，Real-time-PCR法检测TK基因的整合。　　 结果:①酶切、测序鉴定结果表明每步均得到了目的质粒，经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计的相同，插入载体位置正确，测序发现插入片段序列无改变，且开放读码框正确。②pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSVTK基因转染的HEK293细胞，2Gy X线照射1h、6h、12h、24h和48h后，TK基因表达量由相对荧光强度表示，发现荧光强度先增强后减弱，6h时荧光强度最强。各组荧光强度分别为1.86±0.21(1h)，4.53±0.29(6h)，3.72±0.30(12h)，1.31±0.19(24h)和0.33±0.15(48h)，经单因素方差分析发现6h，12h与1h，24h及48h组相比P＜0.05。HEK293细胞经0Gy，1Gy，2Gy，4Gy，8Gy，16Gy不同剂量X射线照射后，荧光强度分别为0.47±0.04，0.56±0.02，2.78±0.12，1.95±0.05，1.81±0.09和1.67±0.18，经方差分析发现照射组与未照射组相比P＜0.05，尤以2Gy的差异最显著。HEK293细胞经不同诱导条件处理后，相对荧光强度分别为0.49±0.03（未诱导组），0.71±0.04（单纯辐射诱导组），0.84±0.04（单纯热诱导组）和1.19±0.03（辐射联合热诱导组），方差分析发现热联合辐射诱导组与未诱导及单纯诱导组相比P＜0.05。③转染pEgr1-Hsp70-HSV-TK的SMMC-7721细胞扩增出正确的TK基因条带。　　 结论:抗肿瘤基因（pCDNA3.1-Egr1-Hsp70-HSVTK）质粒构建成功并且可以被热、辐射双重诱导，为利用其进行靶向性基因治疗打下了基础。　　 第三部分辐射/热激双启动子介导的抗肿瘤基因/磁性复合纳米系统(pEgr1-Hsp70-HSVTK/GCV/PEI-MZF)对肝癌的治疗研究　　 目的:以PEI-Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒作为抗肿瘤基因pEgr-1-Hsp70-HSV-TK的运载体，构建pEgr-1-Hsp70-HSV-TK/GCV/PEI-MZF磁性复合纳米系统（下同），在磁热疗和辐射的双重诱导和联合治疗作用下，研究其对人肝癌细胞和移植瘤的治疗作用。　　 方法:①以修饰的复合材料PEI-MZF作为pEgr1-Hsp70-HSVTK质粒的载体，转染入肝癌细胞SMC7721中，并置于直线加速器下照射和交变磁场中感应升温，诱导HSV-TK基因的表达。②MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)法，流式细胞仪(FCM)评价辐射、热双敏基因pEgr1-Hsp70-HSVTK联合热、放疗对肝癌细胞生长的影响，并采用透射电镜(TEM)和Caspase检测试剂盒初步抗肝癌机制。③将PEI-MZF与pEgr1-Hsp70-HSVTK的复合物注射到裸鼠人肝癌移植瘤中，经外照射和热疗作用3次，21d后处死裸鼠，制作肿瘤组织标本，进行常规病理学检查。　　 结果:　　 ①MTT结果表明PEI-MZF/pEgr1-Hsp70-HSVTK能显著抑制人肝癌SMMC7721细胞的增殖，FCM检测显示其能诱导细胞的凋亡及周期阻滞，且其效果较单纯放疗组及单纯磁流体热疗组明显。电镜照片可见联合治疗组细胞凋亡的形态及磁性材料在细胞内的沉积。Caspase检测结果显示PEI-MZF/pEgr1-Hsp70-HSVTK介导的联合治疗可以激活Caspase家族3和8。②体内抑瘤实验:在PEI-MZF/pEgr1-Hsp70-HSVTK联合外照射和热疗的作用下，联合治疗组的质量抑瘤率与体积抑瘤率分别为IM=80.10％和IV=83.77％，显著高于单纯基因治疗组、单纯磁热疗组、单纯放疗组和PEI-MZF/pHsp70-HSVTK联合热疗组(P＜0.05)，各实验组与对照组相比均有统计学差异(P＜0.05)。病理学肿瘤组织切片发现联合治疗组肿瘤组织坏死较其余组明显。　　 结论:①细胞实验显示:PEI-MZF-HSV-TK复合纳米粒的三重治疗能显著抑制培养人肝癌SMC7721细胞的增殖、诱导细胞凋亡并使细胞周期被阻滞在S期。②体内实验显示:PEI-MZF-HSV-TK介导的热、放疗能增加肿瘤的质量及体积抑制率，导致肿瘤组织坏死，抑制肿瘤增殖，从而具有治疗移植性肝癌的作用。　　 第四部分131I内照射/热激双启动子介导的抗肿瘤基因/磁性复合纳米系统对肝癌移植瘤的治疗研究　　 目的:以PEI-MZF复合纳米粒作为pEgr-1-Hsp70-HSV-TK基因的运载体，构建pEgr-1-Hsp70-HSV-TK/GCV/PEI-MZF磁性复合纳米系统（下同），在磁热疗和131I内照射的双重诱导和联合治疗作用下，研究其对人肝癌细胞和移植瘤的体内治疗作用。　　 方法：①以培养的Bel-7402肝癌细胞皮下注射于裸鼠右前肢皮下，以获得人肝癌的移植瘤模型。②将PEI-MZF/pEgr1-Hsp70-HSVTK的复合物注射到裸鼠人肝癌移植瘤中，经131I内照射和/或热疗作用3次，治疗后每5d测量一次肿瘤直径，绘制肿瘤的生长曲线。21d后处死裸鼠，制作肿瘤组织标本，进行常规病理学检查。核素相关治疗组行核医学检查，于第1、2、7、14天行SPECT显像。　　 结果：①大约2-3周后，裸鼠右前肢皮下长出约80-120mm3的肿瘤。②SPECT显像:在给予放射性核素的1、2、7天均可观察到放射性核素在肿瘤部位的分布，但14天时信号微弱，基本不可探测。③治疗后各组肿瘤的生长趋势:在治疗后5天，治疗组与未治疗组肿瘤的增长速度开始出现差异，到第10天时差异己非常明显。核素、热、基因三联治疗组的生长速率始终低于其他各组。④体内抑瘤实验:PEI-MZF/pEgr1-Hsp70-HSVTK联合核素和热疗组的质量抑制率和体积抑制率分别为IM=83.54％和IV=81.09％，显著高于单纯磁热疗组、单纯放疗组和辐射基因治疗组(P＜0.05)，各实验组与对照组相比均有统计学差异(P＜0.05)。病理学肿瘤组织切片发现联合治疗组肿瘤组织坏死较其余组明显。　　 结论：移植瘤治疗实验显示:热疗、核素内照射介导的PEI-MZF-HSV-TK能增加肿瘤的质量及体积抑制率，导致肿瘤组织坏死，抑制肿瘤增殖，从而具有治疗移植性肝癌的作用。不论是外照射还是核素内照射均可诱导双启动子质粒的表达，且二者的抑瘤率基本相同。