鲟源海豚链球菌的分离鉴定及荚膜多糖基因的进化分析

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2013年8-9月,四川雅安汉源湖养殖的西伯利亚鲟发生一种以体表溃疡、内脏出血和心外膜囊肿为特征的传染病。为明确其病因,本研究从自然发病鱼的肝、脾和肾进行涂片检查和病原菌的分离、人工感染、分离菌的表型特征和分子生物学特征的检测。肝脏和脾脏涂片均观察到大量的革兰氏阳性球菌,从患病鱼体内分离到一株优势菌,革兰氏染色呈G+链状球菌(Ab130920)。人工感染实验证实分离株能够引起试验鱼高死亡率,明确了其病原性。生理生化特性检测,除对精氨酸和乳糖反应外,与海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae) (ATCC29178)基本一致;16S rDNA序列(GenBank登录号:KJ162337)与GenBank中S.iniae 16S rDNA序列同源性最高,在以16S rDNA序列及其GenBank中同源性较高的相关序列构建的系统发育树上,分离菌与S.iniae聚为一族;同时,在基于S.iniae乳酸氧化酶基因的特异性PCR检测中,从分离株基因组DNA扩增出预期大小的870 bp条带,综合表型特征和分子学特征检测结果,进而鉴定分离菌Ab130920为S.iniae,药物敏感性检测发现其对阿莫西林、强力霉素、氟苯尼考等抗菌药物敏感,但对新生霉素、利福平、氧氟沙星耐药。为研究其毒力,本试验进行了血清杀菌实验、血清学分型、对EPC细胞的粘附和侵染实验、毒力基因检测和自然发病鱼的病理学损伤研究。结果表明,菌株在健康西伯利亚鲟的血清中存活率为66.2%,说明血清仅能够杀死部分细菌,存活细菌可能随着血液循环引起全身性的感染;通过对精氨酸和乳糖反应以及随机扩增多态性DNA标记分析,证实Ab130920为血清学Ⅱ型;其对EPC细胞的粘附率为3.28%,侵入率为0.08%,证明菌株可粘附在宿主细胞表面进而进入细胞内定殖;在对cpsD、simA、sagA、pdi和scpl等5种S. iniae毒力基因的多重PCR检测中,分离菌均扩增出相应大小的特异性片段,表明其为一毒力较强的菌株,与人工感染实验的高致病性结果相佐证;组织病理学表明,Ab130920引起西伯利亚鲟全身性感染,导致多个组织器官的出血、细胞变性和坏死,尤其是肝、肾、脾、心和肌肉的严重损伤,表现为坏死性肝炎、肝血管炎、肾小球肾炎、间质性肾炎、急性脾炎、心肌炎、桑葚心和骨骼肌的坏死性肌炎;另外鳃、胃肠道、脑和胰腺也出现不同程度的损伤,表现鳃小片炎、胃炎、肠炎、脑膜炎和胰腺广泛性出血。为研究其荚膜多糖基因的进化关系,对菌株Ab130920和标准菌株ATCC29178的荚膜多糖基因进行PCR扩增,并克隆测序,获得其序列,并与相关文献和GenBank中荚膜多糖基因进行多序列比对,明确英膜多糖基因的变异性,分析其碱基突变引起相应氨基酸的改变。选择变异性较大的基因cpsD,与相关文献和GenBank中的荚膜多糖基因序列进行贝叶斯进化分析。结果表明,S.iniae荚膜多糖基因存在变异的有cpsY、cpsC、cpsD、cpsE、cpsG和cpsY基因,特别是cpsD和cpsE;变异基因在相应位点发生插入、缺失或移码突变,引起相应氨基酸改变;选择cpsD基因进行贝叶斯进化分析,发现分离的鲟源S.iniae Ab130920变异程度高。
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