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1背景与目的胃癌是人类常见的消化道肿瘤,严重的威胁着广西人民的健康。目前临床上主要利用手术、化疗和放疗等手段治疗胃癌,尽管经过多年的基础及临床研究,胃癌在早期诊断及化疗药物研究上取得重大进展,但效果不甚理想,基因治疗已成为肿瘤治疗研究的新领域。转录因子E2F-1基因作为E2F家族的一员,是细胞周期和细胞凋亡决定性调控因子之一。大量研究证实人类大多数肿瘤中E2F-1通路环诸多环节的失调与肿瘤发生有着密切的关系。我们在前期的研究中亦发现,E2F-1在胃癌的发生发展过程中是一个非常稳定、保守的基因,突变的发生率极低,而且E2F-1在胃癌组织中呈高表达,提示E2F-1在胃癌的发生发展过程中具有重要作用。通过构建E2F-1沉默的真核表达载体转染胃癌细胞MGC-803,我们发现转染后的胃癌细胞生长速度明显减慢,细胞凋亡明显增加,并促使MGC-803细胞停滞于M期,提示了E2F-1基因在体外具有癌基因的特性。为了进一步探讨E2F-1沉默后的体内抗肿瘤效应,本课题构建E2F-1基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并运用E2F-1的RNAi慢病毒载体进行了初步的动物实验,同时,应用半定量RT-PCR、Western blot和酵母双杂交等技术初步探讨其发生机制,以期为胃癌的基因治疗打下坚实的基础。2方法2.1根据前期的研究结果,选择干扰E2F-1基因效率最高的siRNA寡核苷酸序列,制备双链DNA oligo (E2F-1-shRNA),应用基因重组技术克隆到pLentiLox3.7(pLL3.7)’慢病毒表达载体中,XbaI和NotI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆。在脂质体的介导下将慢病毒的混合包装载体质粒和包含E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体(pLL3.7-shRNA-E2F-1)共转染293T细胞,包装成病毒48小时后,收集病毒颗粒(Lv-shRNA-E2F-1),孔稀释法测定病毒滴度。另外,设计一条现有基因文库中基因均无同源性的非特异性siRNA序列作为阴性对照序列,同法构建阴性对照组慢病毒载体(pLL3.7-shRNA-NC),同法包装收集阴性对照组慢病毒颗粒(Lv-shRNA-NC),孔稀释法测定病毒滴度。2.2取对数生长期的人胃癌细胞MGC-803常规消化,随机选取5只裸鼠,向其右腋皮下注射200μ1(1×106个细胞)单细胞悬液。待皮下移植瘤最长径长约1cm时,切取移植瘤,剪碎至1-2mm3,再移植回剩余裸鼠的右腋皮下,建立人胃癌裸鼠移植瘤模型。构建人胃癌裸鼠移植瘤模型成功后,将裸鼠编号,随机分为实验组(Lv-shRNA-E2F-1组)、阴性对照组(Lv-shRNA-NC组)和PBS组。隔天向各组分别注射相应的病毒颗粒100μl(5×108TU/ml),共6次,同时测量各组肿瘤的长径和短径以计算肿瘤的体积大小,并绘制其生长曲线；11天后颈椎脱臼处死裸鼠,称量肿瘤重量,取瘤体HE染色后观察其形态改变,应用免疫组化sp法、半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Western Blot)分别检测肿瘤组织中E2F-1的mRNA和蛋白的表达,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测皮下移植瘤细胞凋亡指数,探索基因治疗的效果。2.3根据前期研究中基因芯片的结果,提取移植瘤组织的RNA及总蛋白,采用半定量RT-PCR检测移植瘤组织凋亡相关基因PTEN、Caspase-3、 Caspase-9和NF-κB mRNA的表达情况。采用Western blot检测胃癌细胞内PTEN、Caspase-3前体(pro-caspase-3)、Caspase-9前体(pro-caspase-9)、激活型Caspase-3(cleaved caspase-3)、激活型Caspase-9(cleaved caspase-9)和NF-κB的蛋白含量。2.4根据前期预实验结果,设计引物,以pCMV-E2F-1-HA为模板,去掉E2F-1激活域,PCR扩增E2F-1截短体(309-1241bp),引入酶切位点EcoRI和BamHI,将E2F-1截短体连接至载体pGBKT7中,将构建成功的诱饵表达载体pGBKT7-E2F-1截短体运用化学转化法转化到酵母菌AH109中,采用选择性培养皿分析检测重组质粒的自激活活性和细胞毒性。再将pGBKT7-E2F-1和来源于人正常胃黏膜细胞的cDNA文库质粒顺序转化酵母AH109细胞中,通过营养缺陷型培养基进行阳性克隆的筛选。随后将所得的阳性克隆通过多次营养筛选、X-gal分析、酵母双杂交回转实验对获得的假定相互作用的可靠性加以验证。并对验证后的阳性克隆进行测序。最后借助数据库中的BLAST工具对候选阳性克隆的测序结果进行同源性分析,确定可能发生相互作用的蛋白。3结果3.1双酶切证实所设计的E2F-1及阴性对照组shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确；293T细胞成功包装E2F-1-shRNA的重组慢病毒载体及其阴性对照组的重组慢病毒载体；收集的细胞培养上清液中,Lv-shRNA-E2F-1病毒的滴度为3×109TU/ml,Lv-shRNA-NC病毒的滴度为2×109TU/ml。3.2成功构建人胃癌裸鼠移植瘤模型,三组裸鼠成瘤情况为Lv-shRNA-E2F-1组9只、Lv-shRNA-NC组9只、PBS组8只；各组皮下移植瘤生长曲线表明：与PBS组和Lv-shRNA-NC组比较,Lv-shRNA-E2F-1组肿瘤生长速度明显减慢(P<0.05),PBS组和Lv-shRNA-NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)；移植瘤重量称量结果显示：Lv-shRNA-E2F-1组肿瘤重量(0.637±0.061g)显著小于Lv-shRNA-NC组(2.225±0.079g)和PBS组(2.334±0.087g),(P<0.05),PBS组和Lv-shRNA-NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色后显微镜下确认切取肿瘤为胃癌皮下移植瘤组织；免疫组化E2F-1特殊染色后可见Lv-shRNA-NC组和PBS组的移植瘤细胞细胞核内出现较多的棕褐色颗粒,而Lv-shRNA-E2F-1组的肿瘤细胞细胞核内均未见或偶见棕褐色颗粒(P<0.05)；半定量RT-PCR和Western blot结果均显示Lv-shRNA-E2F-1组E2F-1mRNA及蛋白表达较Lv-shRNA-NC组和PBS组明显下调(P<0.05),PBS组和Lv-shRNA-NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)；TUNEL结果显示：Lv-shRNA-E2F-1组的凋亡指数(18.7±3.6%)明显高于Lv-shRNA-NC组(6.5±0.7%)和PBS组(5.8±0.3%)(P<0.05),PBS组和Lv-shRNA-NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3.3在移植瘤组织中,半定量RT-PCR结果显示：与PBS组和Lv-shRNA-NC组比较,Lv-shRNA-E2F-1组的PTEN、Caspase-3、Caspase-9mRNA表达明显上调,NF-κB mRNA表达明显下调(P＜0.05), PBS组和Lv-shRNA-NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)；Western-blot结果显示：Lv-shRNA-E2F-1组PTEN、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3的蛋白表达量显著高于Lv-shRNA-NC组和PBS组(P<0.05),pro-caspase-9、 pro-caspase-3、NF-κB的蛋白表达量显著低于Lv-shRNA-NC组和PBS组(P＜0.05), PBS组和Lv-shRNA-NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3.4成功扩增了E2F-1截短体,并连接至载体pGBKT7中,成功构建E2F-1截短体的诱饵载体(pGBKT7-E2F-1),经测序比对结果正确。将pGBKT7-E2F-1转化到酵母菌AH109中,经检测无自激活活性和细胞毒性。AH109(pGBKT7-E2F-1)交配筛选人正常胃黏膜细胞的cDNA文库,在四缺培养基上进行筛选,经反复划线和X-gal检测后获得21个阳性克隆。将获得的阳性质粒一对一与诱饵质粒pGBKT7-E2F1重新共转化AH109酵母菌进行验证,获得阳性候选克隆20个,将阳性克隆测序后进行同源性分析鉴定,最终得到18个不同的相关蛋白,分别为：IRF7、CB、GUK1、ATPIF1、 RPSA、SERBP1、ASS1、MESDC2、WISP2、RCN1、CDC42EP1、EXOSC7、 EFEMP1、FSTL3、MT2A、LGALS1、SIVA1、未知基因。4结论4.1成功构建人E2F-1基因RNAi慢病毒载体,为下一步探讨E2F-1沉默对于胃癌生长的体内实验体内实验提供了理论基础和前期准备。为开展靶向E2F-1基因的胃癌基因治疗研究提供了必须的实验工具。4.2瘤内注射靶向沉默E2F-1基因慢病毒颗粒Lv-shRNA-E2F-1可显著抑制人胃癌细胞MGC-803皮下移植瘤的生长速度,降低肿瘤重量,并明显下调移植瘤组织中E2F-1mRNA及蛋白表达水平。该慢病毒表达系统可能是胃癌治疗的一种有效工具。4.3瘤内注射慢病毒颗粒Lv-shRNA-E2F-1抑制移植瘤组织中E2F-1的表达后,可引起PTEN的表达量上升,并激活Caspase-9和Caspase-3,降低NF-κB的表达。提示E2F-1沉默极有可能直接或间接通过PTEN/NF-κB信号传导通路,促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌的生长。4.4成功构建了E2F-1截短体的诱饵载体,经检测无自激活活性和细胞毒性,应用酵母双杂交技术筛选出18个可与E2F-1相互作用的蛋白,结合前期的实验结果,为阐明E2F-1沉默抑制胃癌生长的作用机制提供了新的思路。创新点1目前,对于利用RNA干扰技术使E2F-1基因沉默后,探讨其对胃癌进展过程的影响的相关研究未见报道。本课题从体内实验及E2F-1的蛋白间相互作用出发,初步明确E2F-1基因沉默后对胃癌进展的影响,结合前期体外实验,有助于全面阐明E2F-1沉默在胃癌生长中的作用及其功能机制,为E2F-1作为胃癌治疗的一个新的治疗性和预后性靶基因提供理论和实验依据。2酵母双杂交技术是研究新基因功能的有效手段,本研究拟采用此技术筛查与E2F-1相互作用的蛋白,这在国内外尚属首次。以寻找E2F-1的相互作用蛋白入手,有助于客观真实地阐明其作用的功能机制。