高浓度CO2处理诱导涩柿果实后熟软化的调控机制研究

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柿(Diospyros kaki Thunb.)是原产于中国的多年生落叶果树,根据果实成熟时是否具有涩味,可将其分为甜柿和涩柿两大类。我国主栽柿品种多为涩柿,果实采后脱涩技术十分关键。然而,包括高浓度CO2(95%CO2)在内的大多数脱涩处理会导致果实过度软化,严重影响其商品价值,限制了产业发展。本文以涩柿‘镜面柿’为材料,通过分析转录组、基因表达、调控效应、结合能力、蛋白互作等内容,阐明了高浓度CO2处理诱导乙烯和脱落酸积累,引起下游细胞壁降解,从而导致涩柿果实后熟软化的调控机制。主要研究结果如下:1、转录组分析获得227个可能参与涩柿果实后熟软化的候选基因。采后高浓度CO2脱涩处理会加速‘镜面柿’果实软化,而高浓度CO2+1-MCP混合处理则可使果实脱涩保脆。通过比较分析这些处理与对照的转录组数据,筛选获得了227个只受高浓度CO2处理调控的差异基因,推测为可能参与涩柿果实后熟软化调控的候选基因。进一步分析发现,这些基因中包含12个转录因子、3个除转录因子外的转录水平调控因子、3个蛋白激酶编码基因以及3个植物激素合成相关基因等。2、鉴定了NAC-ERF复合体协同调控细胞壁降解,引起果实软化。利用双荧光素酶实验发现,在上述鉴定的12个转录因子中,Dk NAC9对前期报道的细胞壁纤维素降解酶编码基因Dk EGase1具有调控效应。进一步通过EMSA实验发现,Dk NAC9能够特异结合Dk EGase1启动子。同时,Dk NAC9和已报道的柿软化相关转录因子Dk ERF8/16形成转录复合体,对Dk EGase1启动子的转录活性产生协同增效作用。以上结果说明,Dk NAC9-Dk ERF8/16复合体通过协同调控细胞壁纤维素降解,参与了涩柿果实后熟软化过程。3、发现高浓度CO2处理促进乙烯和脱落酸积累以调控涩柿果实后熟软化。研究发现,乙烯和脱落酸含量在高浓度CO2处理的柿果实样品中较高。进一步分析发现,差异表达的RNA结合蛋白Dk RBM24-1可以特异结合乙烯、脱落酸合成相关基因Dk ACS1和Dk NCED2+3’的m RNA 3’UTR区以调控它们的转录水平。另外,酵母单杂筛库发现,转录因子Dkb HLH11可以特异结合脱落酸合成相关基因Dk NCED1+3’的启动子。由于Dkb HLH11表达在不同处理中无显著差异,进一步分析发现了差异表达的蛋白激酶Dk MAPKKK1,可与Dkb HLH11发生蛋白互作,增加Dkb HLH11对Dk NCED1+3’启动子的激活活性。综上所述,本论文解析了NAC-ERF复合体协同调控涩柿果实细胞壁降解的机制。另外,高浓度CO2处理通过诱导共同(Dk RBM24-1)及特异(Dkb HLH11)的调控因子来积累乙烯和脱落酸,导致涩柿果实后熟软化。以上结果可加深对柿果实成熟软化以及植物激素调控机制的理解,丰富果实成熟的调控研究,同时为利用生物技术改善果实品质提供理论依据与潜在靶标。
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