研究背景近年来围产医学及新生儿疾病研究有很大发展,但缺氧缺血性脑病(HIE)仍是全世界新生儿死亡的重要原因。在发达国家HIE发病率通常为2-3/1000活产儿,而发展中国家这一数据提高到26/1000活产儿。这些患儿中约15-20%通常死于新生儿重症监护室(NICU),而幸存者常遗留慢性神经功能障碍,其中脑瘫发病率为10-20%、视听障碍为40%、认知和行为异常(例如癫痫、自闭症及精神发育迟缓)等,给家庭及社会带来沉重负担。目前针对围产期脑损伤的干预措施如亚低温、促红素等已经在临床应用中显现出其降低神经功能障碍发生率的作用。然而,这些治疗方法并非在所有病例中都能够发挥作用,例如亚低温治疗并不适用于早产儿和低出生体重儿,因此迫切需要更好地了解脑损伤的发生机制,从而减少围产期脑损伤后的细胞死亡,提高细胞存活率,并进一步探索促进未成熟脑的再生和修复的方法。在缺氧缺血病理发生发展过程中,损伤时间和治疗时机都扮演着重要角色,在HI后初级阶段(损伤后1到6小时),以氧化代谢、炎症反应及激活凋亡级联反应为主;而在HI后6至48小时,则出现以磷酸盐储量耗尽、释放兴奋性神经递质和自由基产生为特征的二次能量衰竭损伤;在急性缺血数月后第三阶段,则存在着细胞死亡、受损脑重塑和星形胶质细胞反应性增生等过程。在这一些列病理发生发展过程中,针对初级阶段细胞死亡以及继发性能量衰竭的治疗目前被认为是最有效减轻HIE的手段和方法,而不论在细胞凋亡或磷酸盐耗尽导致能量衰竭过程中,线粒体都发挥着核心调节作用。线粒体是具有多种细胞功能的多能细胞器,线粒体作为细胞的能量车间其作用涉及对生理代谢,应激反应以及细胞死亡的调节,而这些作用均在HI引起的脑损伤过程中发挥重要作用。线粒体是凋亡性细胞死亡的关键调节细胞器,细胞损伤后线粒体的通透性发生改变,继而导致细胞死亡相关蛋白从线粒体释放入胞质当中,这些细胞死亡相关蛋白包括细胞色素C(Cyt c)和凋亡诱导因子(AIF),它们分别能够触发半胱天冬酶(caspase)依赖性和caspase非依赖性的细胞凋亡途径。相比较于成熟脑这些过程在未成熟脑中的作用更加突出,并且针对线粒体的干预措施已经显示出对抗未成熟脑损伤的新希望。自吞噬-在多种应激状态下可被激活的一种重要的降解蛋白的生理机制,是目前已知的唯一的细胞器降解途径。自吞噬能够回收氨基酸和脂肪酸,产生能量并清除受损的细胞器,因此,自吞噬在细胞存活当中发挥着关键作用。但与此同时,过度的激活自噬反而会诱导细胞死亡并触发细胞凋亡或者坏死程序。线粒体在细胞生命活动中具有重要作用,受损伤的或不需要的线粒体必须被有效清除,以保证细胞正常生命活动的进行。线粒体自噬(Mitophagy)就是这样一种通过自噬机制选择性清除受损伤或不必需的线粒体的过程。线粒体自噬的异常可能与神经退行性疾病,糖尿病和肿瘤的发生有密切关系。线粒体自噬的分子调控机制目前是线粒体和细胞自噬研究领域同行广泛关注的焦点问题,在HI后新生儿脑损伤发展中的作用尚不清楚。本研究将以未成熟脑损伤模型作为研究对象,采用转基因小鼠建立动物模型,从基因和蛋白水平探索线粒体在缺氧缺血引起的未成熟脑损伤发生发展中的作用,同时探索相关药物对未成熟脑损伤的保护作用,为新生儿缺氧缺血性脑损伤的预防和诊治提供理论基础。第一部分 线粒体蛋白CHCHD4在新生鼠脑损伤中的作用目的线粒体通过释放潜在毒性蛋白进入细胞质影响缺氧缺血性脑损伤发生过程。CHCHD4是一种线粒体膜间隙蛋白,在线粒体膜间蛋白的传输过程中及凋亡诱导因子(AIF)的构成中都发挥重要作用。本研究主要是探索减少CHCHD4含量对于新生小鼠脑缺氧缺血后线粒体功能和脑损伤的影响。方法9日龄C57BL/6J野生型小鼠(WT),CHCHD4下调小鼠(CHCHD4+/-)左侧颈总动脉结扎后暖箱内缺氧50分钟,送回鼠笼休息并分别于缺氧缺血后6小时、24小时、3天及4周处死评价脑损伤情况并探索其可能的机制以及对远期的神经元增殖分化影响。结果小鼠CHCHD4杂合敲除造成的CHCHD4单倍体缺乏与野生型小鼠相比,可以有效减轻AIF相关的损伤,减少超氧化物歧化酶2从线粒体中释放从而减少神经元细胞的死亡。CHCHD4+/-小鼠的脑灰质损伤体积相较于WT小鼠在缺氧缺血后3天和四周分别减少了 21.5%和31.3%。然而,CHCHD4缺乏对线粒体生物合成、线粒体融合、分裂、神经干细胞增殖、神经祖细胞分化等均无明显影响。同时,不论在生理条件下还是在缺氧缺血后,CHCHD4单倍体缺乏对于p53蛋白的表达和分布,以及p53通路相关基因均无明显的改变。结论CHCHD4下调具有神经保护作用,其机制与线粒体膜间隙蛋白的释放减少有关。因此,通过调控线粒体蛋白CHCHD4相关通路,可能成为预防和治疗新生儿脑损伤的潜在靶标。第二部分 二氯乙酸对线粒体代谢和未成熟脑损伤的作用目的评估二氯乙酸(DCA)治疗新生小鼠缺氧缺血脑损伤的效果及其可能的分子机制。方法采用出生后第9天的新生雄性小鼠制作缺氧缺血脑损伤模型,麻醉后结扎左侧颈总动脉并缺氧40min后放回母鼠身边,在缺氧后立即给予腹腔注射DCA,并在24小时后给予再次注射DCA,HI后72小时处死小鼠。结果二氯乙酸可以有效地减轻未成熟脑损伤,HI后72小时生理盐水对照组梗塞面积10.8 ± 1.9 mm3,DCA注射组梗塞面积为5.0±1.0 mm3,DCA有效的减少了 54.2%的HI引起的脑梗塞面积(p = 0.008)。DCA药物治疗组,凋亡诱导因子(p = 0.018)和caspase-3(p = 0.021)阳性细胞数目均显著下降。同时,在应用DCA后,线粒体丙酮酸脱氢酶活性和乙酰辅酶A水平均显著升高(p = 0.039,p =0.024)。结论DCA治疗可以降低HI后新生小鼠脑损伤,这可能和丙酮酸活性酶升高和随之线粒体代谢增加及凋亡细胞死亡减少相关。第三部分 抑制自吞噬在未成熟缺氧缺血性脑损伤中的作用目的围产期窒息可以诱发神经元细胞的死亡造成脑损伤,并与儿童期不可逆的神经功能障碍密切相关。因此,对缺氧缺血后的神经细胞死亡机制的研究就显得尤为迫切。本研究采用新生儿缺氧缺血性脑病尸检样本以及新生小鼠缺氧缺血性重度脑损伤模型探索条件性敲除神经元自吞噬相关基因Atg7后对神经细胞死亡及脑损伤所产生的影响。方法采用小鼠缺氧缺血性(HI)脑损伤模型,以及新生儿缺氧缺血性脑病尸检样本,通过选择性敲除小鼠神经元中Atg7基因,探索自吞噬对于未成熟脑损伤中的神经细胞死亡及预后的影响。结果选择性敲除神经元Atg7基因可以阻止缺血缺氧诱导的自吞噬,跟野生型小鼠相比减少42%的缺氧缺血后脑损伤面积,也同时减少了大脑多区域的细胞死亡情况,包括caspase依赖性或非依赖性的凋亡途径。此外,我们也发现严重围产期窒息导致的死亡新生儿的豆状核中,与对照组相比神经元自吞噬显著增加,自噬相关指标MAP1LC3B/LC3B(微管相关蛋白1轻链3)比值及LAMP1(溶酶体相关膜蛋白1)和CTSD(组织蛋白酶D)阳性细胞数均发生改变。结论选择性敲除神经元Atg7基因抑制自吞噬可以有效的减少缺血缺氧后神经细胞的死亡,及综合性脑损伤情况。抑制大脑缺氧缺血后增强的自噬水平可以作为潜在的治疗新生儿严重缺氧缺血性脑病的新靶点。