论文部分内容阅读
类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）简称类鼻疽菌,属兼性胞内革兰氏阴性菌,主要存在于水源和土壤中,可通过多种途径（如呼吸道、消化道等）感染人和动物,引起一种称为类鼻疽（Melioidosis）的人兽共患病。类鼻疽的临床症状多样,包括难治性肺炎、坏疽以及致死性败血症等,治疗周期长,费用高,且存在较高的复发率。鉴于类鼻疽菌极易传播、致死率高、耐药性强,且目前尚无有效的疫苗,已被WHO列为B类生物恐怖剂,严重危害人类健康。调查结果显示在全球范围内,类鼻疽病的诊断严重不足。目前,针对类鼻疽菌的实验室诊断方法（如细菌学培养、分子生物学方法和蛋白组学方法等）均存在一定的局限性,且没有商业化、可靠的类鼻疽菌快速诊断方法应用于临床,因此,建立一种简便快速的诊断方法迫在眉睫。ELISA是一种标准的血清学检测方法,也是进一步发展快速检测方法的基础。已有研究报道显示类鼻疽菌溶血素共调节蛋白1（hemolysin coregulated protein 1,Hcp1）的表达水平在其感染宿主的过程中会显著升高,并且能够与类鼻疽患者血清发生强烈的抗原抗体反应,这提示我们该蛋白可诱导机体产生特异性抗体,具有作为血清学诊断抗原的潜在应用价值。基于此,本研究采用DNA重组技术,通过原核表达的方式获得了分子量大小为18 k Da左右的高纯度重组Hcp1（recombinant Hcp1,r Hcp1）蛋白。进一步,我们对r Hcp1蛋白的免疫学性质进行了初步的研究:首先以r Hcp1蛋白免疫小鼠,利用间接ELISA实验检测抗血清效价,结果显示r Hcp1蛋白表现出较强的免疫原性,刺激动物产生的抗体效价可达1:512 000。接着利用免疫印迹实验、免疫荧光实验对r Hcp1蛋白及其抗血清的特异性进行研究,结果显示r Hcp1蛋白能够与类鼻疽病人的血清发生特异性结合,而与来自疫区阴性血清（未感染类鼻疽菌体检者的血清）不发生结合,二者差异极显著;r Hcp1抗血清仅与类鼻疽不同临床菌株发生特异性结合反应,而与其他病原菌不发生反应,说明r Hcp1蛋白具有较强的特异性。据此,我们初步认为r Hcp1可以作为类鼻疽血清学诊断的候选抗原靶标。类鼻疽菌表面含有丰富的多糖,包括脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）、荚膜多糖（capsular polysaccharides,CPS）和胞外多糖（exopolysaccharides,EPS）等,这些外膜多糖作为重要的毒力因子,在类鼻疽菌的致病机制和免疫调节中发挥着重要的作用,具有作为诊断抗原和疫苗候选抗原的潜能。由于类鼻疽菌可以表达多种LPS和CPS,而截至目前,尚无关于我国类鼻疽菌临床分离株表面多糖的相关报道,对其外膜多糖抗原类型及其生物学功能尚不清楚。基于此,本研究对不同临床菌株进行了外膜多糖的纯化、结构表征和免疫原性研究。首先采用分步提取的方式获得了不同类鼻疽菌临床菌株的胞外多糖,并利用离子交换层析和分子筛层析进行分离纯化,高效凝胶渗透色谱鉴定结果显示纯化后的三种抗原成分BPC004-BPPI-b1、BPC006-BPPI-b1和BPC010-BPPI-b1组成相对均一,分子量大小均分别为931 k Da,640 k Da和546 k Da。进而利用GC-MS、甲基化分析、FT-IR和1D/2D NMR进行精细结构的表征,结果显示BPC004-BPPI-b1的结构为[3)-2OAc-β-D-6-deoxy-Hepp-（1→3）-β-D-6-deoxy-Hepp-（1→]重复单元组成的线性多糖链;BPC006-BPPI-b1主要由[3-（a-D-Manp-1→3-a-D-Manp）4-2Me-a-L-6d Talp-1→]构成;BPC010-BPPI-b1的结构与BPC006-BPPI-b1基本相同。进一步,对这三种多糖抗原的免疫学性质以及抗原结构对其免疫活性的影响进行了初步研究:首先采用间接ELISA法对多糖抗原的免疫原性和免疫反应性进行了研究,结果显示三种糖抗原均具有较好的免疫原性,且能够与类鼻疽病人的血清发生特异性结合反应,而与疫区阴性血清不发生结合反应。接着采用间接ELISA法对多糖抗原的抗血清与不同临床菌株的交叉反应情况进行了研究,结果显示抗血清可与本研究中所选取的80%临床菌株发生交叉反应,推测本文所表征的[3）-2OAc-β-D-6-deoxy-Hepp-（1→3）-β-D-6-deoxy-Hepp-(1→]和[3-（a-D-Manp-1→3-a-D-Manp）4-2Me-a-L-6d Talp-1→]两种抗原可能在类鼻疽菌的血清学诊断和疫苗开发方面都具有较大的应用价值。最后利用FT-IR、免疫印迹及竞争性ELISA法对多糖抗原表位上的乙酰化修饰基团对其免疫原性的影响进行了研究,结果显示抗原表位上的乙酰化修饰基团对其免疫活性十分重要,脱去乙酰基的抗原丧失了与抗体的结合能力。综上所述,本文的研究结果将为类鼻疽菌诊断抗原和疫苗候选抗原的筛选提供新的理论依据和数据支撑。