1型糖尿病（Type1diabetes mellitus, T1DM）是一种以长期慢性炎症和胰岛β细胞大量损伤而导致胰岛素分泌不足，引起机体糖脂代谢紊乱为特征的器官特异性自身免疫疾病。T1DM的发病率呈逐年递增趋势，其严重的并发症已成为儿童、青少年致残和早亡的重要因素。因此，T1DM是当今急需解决的健康问题之一。引起T1DM的因素多而复杂，其中T细胞持续活化而导致胰岛β细胞损伤是T1DM病情发展中的重要一环。T细胞中的CD8+T细胞致β细胞死亡的作用已有深入研究，但由CD4+T细胞或巨噬细胞等产生的细胞因子，尤其是参与T细胞活化的共刺激分子在该病中的作用机制仍不是很清楚。深入研究导致T细胞活化的共刺激分子在β细胞免疫损伤中的作用机制，对于发展有效的T1DM防治策略具有重要的理论意义和实际价值。早期的研究发现合理封闭一些共刺激途径可以降低T1DM的发生。LIGHT-HVEM/LTβR是20世纪末发现的共刺激分子，多个研究小组报道LIGHT信号通路通过参与T细胞的活化，诱导细胞凋亡等在类风湿性关节炎和自身免疫性肝炎等多种自身免疫疾病的病理发生中起着积极的作用。已有报道认为，LIGHT-LTβR信号途径可促进胰腺内淋巴结的发育而募集活化T淋巴细胞对β细胞造成免疫损伤而导致糖尿病的产生；用LTβR-Ig治疗NOD小鼠，早期给药可预防胰岛炎和TIDM的发生，胰岛炎晚期给药可逆转胰岛炎和延缓糖尿病发生，提示LIGHT信号通路在TIDM的发生、发展中发挥重要作用。但LIGHT信号通路在T1DM的胰岛细胞凋亡中的直接作用及相关分子机制，尚未见报道。针对上述研究现状，本课题结合现代分子遗传学、细胞学和免疫学等学科的前沿技术与方法，以LIGHT-/-NOD小鼠为模式动物和以MIN6细胞株为主要细胞模型，从在体（in vivo）和离体（in vitro）等多个方面，探讨LIGHT信号通路在T1DM发生、发展中的作用及机制，拟解决以下几个问题：1、动态检测NOD小鼠胰组织LIGHT及其受体HVEM、LTβR的表达以及外周血中相关细胞因子的分泌情况，探讨LIGHT信号通路以及有关细胞因子的分泌与T1DM病情发展的相关性；2、建立LIGHT-/-NOD小鼠动物模型，通过生化指标检测、胰腺病理分析、小鼠糖尿病发病情况统计、细胞因子分泌等观察LIGHT信号缺失（LIGHT-/-NOD小鼠）时，NOD小鼠糖尿病病情变化。通过对比分析，明确LIGHT途径在胰岛β细胞免疫损伤中的作用；3、以NOD小鼠胰岛素瘤细胞株MIN6和Bal b/c小鼠的原代胰岛细胞为模型，分别用rmLIGHT和rmIFN-γ单独或联合处理细胞，利用MTT、FCM等技术观察LIGHT途径对胰岛细胞存活及凋亡的影响；4、采用Western blot或免疫细胞化学等技术检测目标基因（STAT1、NF-κB、Bcl-2家族、Caspase家族、PARP等）的蛋白表达水平，研究阐明LIGHT信号通路诱导胰岛β细胞凋亡的分子机制。预期的研究结果不但有助于阐明胰岛β细胞的有关损伤机制，并且可为T1DM的临床治疗研究提供新的思路和方法。第一部分LIGHT及受体的表达随NOD小鼠糖尿病病情发展的变化目的：探讨LIGHT及受体HVEM、LTβR的表达以及细胞因子IFN-γ和IL-4的分泌变化与T1DM发生、发展的关系。方法：4周龄雌性NOD小鼠（n=30）饲养于SPF级动物房，在无任何干预条件下，定期监测血糖、胰岛素水平。一周内连续两次检测非空腹血糖水平≥13.8mmol/L的小鼠诊断为糖尿病，观察NOD小鼠自发产生糖尿病的情况；分别随机取未产生糖尿病、糖尿病发病1周、糖尿病发病2周、糖尿病发病4周的NOD小鼠各3只，处死收集血清并提取小鼠胰腺总RNA和总蛋白，采用Real-time PCR和Western blot技术检测LIGHT及其受体HVEM、LTβR的表达；ELISA法检测血清炎症相关细胞因子（IFN-γ、IL-4）分泌。结果：30周龄时，NOD小鼠糖尿病累积发病率为81.5％（22/27）；Real-timePCR和Western blot结果显示，糖尿病发病4周的NOD小鼠胰腺组织LIGHT、LTβR和HVEM的表达较未产生糖尿病组明显上调（P <0.05）。血清中Th1细胞因子IFN-γ分泌明显增加，而Th2细胞因子IL-4分泌减少。结论：NOD小鼠发生糖尿病时，LIGHT、LTβR和HVEM表达明显上调，血清中促炎症细胞因子IFN-γ分泌增加，抑制炎症细胞因子IL-4分泌减少，上述因素与T1DM的发生发展相关。第二部分LIGHT途径信号缺失对NOD小鼠糖尿病病情的影响目的：观察LIGHT信号缺失时NOD小鼠（LIGHT-/-NOD小鼠）糖尿病病情变化，通过对比分析明确LIGHT途径在胰岛β细胞损伤中的作用。方法：将LIGHT-/（-LIGHT KO）小鼠与NOD小鼠进行配对得到LIGHT+/-NOD子代，再将其与NOD小鼠连续回交十代以上，LIGHT+/-NOD子代再自交，即可得到LIGHT-/-NOD小鼠。4周龄LIGHT-/-NOD小鼠（n=25）和对照同龄NOD小鼠（LIGHT＋/＋NOD小鼠）（n=25）饲养26周，动态检测2组小鼠的体重、血糖，利用腹腔注射葡萄糖耐量试验（Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT）分析小鼠体内胰岛素活性情况，并统计小鼠的糖尿病累积发病率。两组随机取11周龄和20周龄小鼠各5只处死，收集血清，采用ELISA法检测血清细胞因子IFN-γ、IL-4的分泌；HE法染色胰腺组织对胰岛炎进行分级；胰岛原位细胞凋亡检测技术（TUNEL法）观察胰岛细胞凋亡情况。结果：LIGHT-/-NOD小鼠与LIGHT+/+NOD小鼠相比，糖尿病的累积发病率显著降低（LIGHT-/-NOD组：13.3％，2/15；LIGHT+/+NOD组：73.3％，11/15）；LIGHT-/-NOD小鼠腹腔注射葡萄糖耐量试验无异常，而对照组IPGTT明显减退；LIGHT-/-NOD小鼠胰岛绝对数目明显多于对照组，胰岛炎以零级、一级为主，对照组胰岛炎以二至四级为主；LIGHT-/-NOD小鼠未见明显的胰岛细胞凋亡；LIGHT-/-NOD小鼠血清中，与1型糖尿病的发病机制密切相关的炎性细胞因子IFN-γ水平显著低于对照组，保护β细胞的抑制炎症细胞因子IL-4水平稍高于对照组。结论：（1）LIGHT信号通路信号缺失时可降低炎性细胞因子IFN-γ的分泌，改善NOD小鼠的胰岛炎症；（2）LIGHT信号缺失时可减轻胰岛细胞凋亡程度，改善葡萄糖耐量异常，降低NOD小鼠糖尿病的发病率。第三部分LIGHT-LTβR信号通路对胰岛细胞凋亡的影响目的：探讨LIGHT是否直接参与炎性细胞因子诱导的胰岛细胞凋亡。方法：培养NOD小鼠胰岛素瘤MIN6细胞株和原代胰岛细胞。分别用rmLIGHT和rmIFN-γ单独或联合处理细胞，以rmTNF-α为阳性对照。采用MTT法检测细胞存活情况；Hoechst33258染色细胞核，激光共聚焦显微镜观察细胞核形态变化；FCM检测细胞凋亡百分率；DNAladder电泳检测细胞DNA的片段化等，以此分析LIGHT对胰岛细胞凋亡的影响。运用抗LTβR或HVEM多抗阻断LIGHT途径，用MTT和FCM法观察胰岛细胞活力和凋亡的变化，进一步明确LIGHT途径对胰岛细胞凋亡的影响。结果：LIGHT或IFN-γ单独作用时，仅对胰岛细胞产生轻微的毒性作用，但LIGHT联合IFN-γ处理细胞，两者的作用增强具有协同性且呈时间依赖性地明显抑制了细胞活力。MIN6细胞经LIGHT和IFN-γ联合处理后，细胞形态由不规则瓦片状变圆甚至漂浮，细胞密度显著降低；细胞核固缩、呈致密浓染，出现凋亡小体；细胞核内基因组DNA出现明显的片段化；细胞早期凋亡率显著增加，但坏死或晚期凋亡率变化不明显。运用抗LTβR的多抗阻断LIGHT途径后，能明显增加胰岛细胞的活力，降低LIGHT联合IFN-γ诱导的细胞凋亡率。结论：LIGHT主要结合受体LTβR，直接参与了炎症细胞因子IFN-γ诱导的胰岛细胞凋亡；LIGHT与IFN-γ的作用存在协同效应。第四部分LIGHT-LTβR信号通路诱导胰岛细胞凋亡的分子机制目的：探讨LIGHT-LTβR通路介导的胰岛细胞凋亡中所涉及的下游基因表达变化，进一步明确LIGHT途径致胰岛细胞凋亡的分子机制。方法：培养NOD小鼠胰岛素瘤MIN6细胞株，分别用rmLIGHT和rmIFN-γ单独或联合处理细胞，采用Western blot或免疫细胞化学等技术检测转录因子NF-κB和STAT1的蛋白表达水平；检测线粒体内Cyto C的释放；分析凋亡调节因子Bcl-2家族（Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Bak和Bid）以及凋亡执行者Caspase家族（Caspase-3,-8,-9）和Caspase作用底物PARP等基因在不同时相点的蛋白表达变化。分别利用NF-κB、STAT1、Caspase、Caspase-3的特异抑制剂PDTC、Fludarabine、Z-VAD-FMK、Ac-DEVD-CHO预先处理细胞影响信号传递，再用相应细胞因子处理，MTT、FCM等技术检测细胞的存活或凋亡情况，Western blot技术检测Bcl-2家族主要成员的蛋白表达变化；利用Caspase-3活性测定试剂盒检测Caspase-3活性。免疫组织化学法观察LIGHT-/-NOD小鼠胰岛细胞内Bax的表达和Caspase-3的活化情况。结果：LIGHT联合IFN-γ作用于MIN6细胞，能明显激活转录因子NF-κB和STAT1；凋亡调控因子Bcl-2家族的抗凋亡成员Bcl-XL表达下调，促凋亡成员Bak和Bax上调；凋亡执行者Caspase家族成员Caspase-3,-8,-9被剪切活化，Caspase作用底物PARP被裂解失活；NF-κB、STAT1的特异抑制剂PDTC、Fludarabine逆转了由细胞因子诱导的Bcl-XL的表达下调和Bax、Bak的表达上调，细胞活力明显增强。LIGHT-/-NOD小鼠胰岛细胞内Bax表达下调，Caspase-3的活化被抑制。结论：（1）LIGHT途径诱导胰岛细胞凋亡的分子机制可能与其协同另一炎症细胞因子IFN-γ，激活转录因子NF-κB和STAT1有关；（2）活化的NF-κB、STAT1下调Bcl-XL，上调Bax/Bak，促进了线粒体Cyto C释放，激活Caspase-9,-3，导致细胞凋亡。