目的：　　 获得性免疫缺陷综合征(acquired immuno deficiency syndrome,AIDS)又称艾滋病,是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的以CD4+T细胞显著减少为主要特征,最终伴有反复机会性感染、恶性肿瘤而导致死亡的感染性疾病。在HIV感染过程中,天然免疫和获得性免疫系统一方面受到病毒感染的损害,细胞数量和功能发生变化,另一方面依旧发挥抗病毒的作用,抑制病毒复制。自然杀伤细胞(natural killercell,NK)是天然免疫系统中的重要效应细胞,可直接杀伤肿瘤或病毒感染的细胞,在机体早期控制肿瘤和病毒感染中发挥重要作用。研究表明NK细胞也具有免疫调节功能,主要通过与其他免疫细胞如T、DC、巨噬和内皮细胞等相互作用及分泌细胞因子与趋化因子两种方式发挥免疫调节作用。最近研究发现NK细胞可通过分泌免疫调节性细胞因子白细胞介素10(inter leukin-10,IL-10)、转移生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)调节自身及其他免疫细胞反应。目前订研究只发现正常人NK细胞在体外刺激下,可以分泌IL-10、TGF-β,但足对于HIV感染者NK细胞分泌调节性细胞因子IL-10、TGF-β情况,及其与HIV疾病进展的关系,国内外尚未报道。本研究以感染HIV的男男同性恋人群为研究对缘,应用多色流式细胞分析技术,探讨HIV感染者NK细胞分泌IL-10和TGF-β情况以及与HIV感染疾病进展之间的关系。　　 方法：　　 1、研究对象　　 29例HIV抗体阳性感染者,未接受过抗病毒治疗,且无明显机会性感染。12例正常对照(HIV-negativenormal control,NC),HIV抗体阴性,血常规及肝肾功正常,无免疫系统疾病。本研究内容获得参加者的书面知情同意。　　 2、CD4+T细胞绝对值检测　　 将20μlBD公司CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP试剂加入绝对计数管中,逆向加样法加入50μl混匀的抗凝全血,室温避光15min,加入1×免洗溶血素450μl,室温避光15min,应用FACSCalibur流式细胞仪进行检测,MultiSET软件分析结果,得到CD4+T淋巴细胞的绝对值。　　 3、NK细胞百分比及其分泌IL-10、TGF-β的检测　　 密度梯度离心法提取外周血单个核细胞:加或不加rIL-12(10ng/ml)与rIL-15(50ng/ml)刺激PBMC,1小时后加GolgiStop,37℃,5%CO2共孵育培养6小时;用PBS洗涤PBMC后,加抗体CD3-Percp与CD56-PE-cy7进行表面避光染色,4℃,30分钟;使用BDCytofix/CytopermTMFixation/PermeabilizationKit进行破膜20分钟,洗涤细胞后,用IL-10-APC和TGF-β-PE胞内避光染色,4℃,30分钟:洗涤细胞后用1%多聚甲醛固定。应用FACSLSRII流式细胞仪进行检测,BDFACSDivaTM软件分析结果。　　 4、IL-10、TGF-β对NK细胞功能影响的测定　　 分别采用重组IL-10、TGF-β与PMBC共培养6小时、24小时、48小时,直接标记CD107a-PE,在收细胞前5小时加GolgiStop(美国BD公司),37℃,5%CO2共孵育培养;用PBS洗涤PBMC后,加抗体CD3-Percp与CD56-Pe-cy7(美国BD公司)进行表面避光染色,4℃,30分钟;使用BDCytofix/CytopermTMFixation/PermeabilizationKit(美国BD公司)进行破膜20分钟,洗涤细胞后,用IFN-γ-APC(美国BD公司)胞内避光染色,4℃,30分钟;洗涤细胞后用1%多聚四醛固定。应用FACSLSRII流式细胞仪进行枪测,BDFACSDivaTM软件分析结果。　　 5、HIV病毒载量测定　　 取1mlEDTA抗凝血浆,采用Roche公司COBAS(R)AmpliPrep(R)/COBAS(R)TaqMan(R)System自动载量仪上以实时荧光定量PCR方法测定病毒载量。全部操作按照操作说明书进行。　　 6、统计学分析　　 应用SPSS17.0软件包进行统计分析,所有数据以中位数表示,两组间实验指标的比较采用Mann-WhitneyU检验,相关性分析采用Spearman秩相关检验,P＜0.05为有统计学意义。　　 结果：　　 一、HIV感染者NK细胞及各亚群分泌IL-10、TGF-β的特点　　 1、HIV感染者NK细胞及各亚群构成情况　　 本研究对HIV感染者及正常对照组(NC组),检测NK细胞及各亚群占淋巴细胞百分比。结果显示:与NC组相比较,HIV感染者NK细胞、CD56dimNK细胞百分比均降低(P=0.014,P=0.015),CD56brightNK细胞百分比有降低趋势,但无统计学差异。　　 根据CD4高低分组:HIV感染者NK细胞、CD56dimNK细胞百分比在CD4＜350个/ul组均低于NC组(P=0.012,P=0.014),CD56brightNK细胞百分比在CD4≥350个/ul组低于NC组(P=0.041)。　　 根据病毒载量高低分组:病毒载量≥104拷贝/ml组HIV感染者NK细胞、CD56dimNK细胞百分比亦低于NC组(P=0.020,P=0.022),CD56brightNK细胞百分比有降低趋势,但无统计学差异。病毒载量＜104拷贝/ml组NK细胞及各亚群百分比均有有降低趋势,但无统计学差异。　　 2、HIV感染者NK细胞分泌IL-10、TGF-β情况　　 应用多色流式细胞仪胞内细胞因子染色(ICS)方法检测NK细胞分泌IL-10和TGF-β水平。结果显示:HIV感染者NK细胞分泌IL-10、TGF-β水平有高于健康对照组(NC组)趋辨,但无统计学差异。　　 根据CD4高低分组:HIV感染者NK细胞分泌IL-10、TGF-β水平有高于健康对照组趋势,但无统计学差异。　　 根据病毒载量高低分组:病毒载量＜104拷贝/ml组HIV感染者NK细胞分泌TGF-β水平高于NC组(P=0.049)。　　 CD4＜350个/ul且病毒载量≥104拷贝/mlHIV感染者NK细胞分泌IL-10、TGF-β水平亦有高于NC组趋势,但无统计学差异。　　 3、HIV感染者NK细胞各及亚群分泌IL-10、TGF-β水平与CD4+T细胞数量及HIV病毒载量的相关性　　 HW感染者NK细胞分泌IL-10、TGF-β水平与CD4+T细胞数量、HIV病毒载量无显著相关性,无统计学意义。CD56brightNK细胞分泌IL-10水平与HIV病毒载量显著正相关(r=0.525,P=0.003),而CD56dimNK细胞分泌IL-10水平与HIV病毒载量无显著相关性。　　 根据CD4高低分组:CD4＜350个/ul组HIV感染者NK细胞分泌IL-10水平与CD4+T细胞数量呈负相关(r=-0.582,P=0.037),而CD4≥350个/ul组HIV感染者NK细胞分泌IL-10水平与CD4+T细胞数量无相关性(r=0.221,P=0.412)。　　 根据病毒载量高低分组:病毒载量≥104拷贝/ml组HIV感染者NK细胞分泌IL-10水平与HIV病毒载量正相关(r=0.542,P=0.020)。在CD56dimNK细胞和CD56brightNK细胞亚群中发现相似结果:分泌IL-10水平与HIV病毒载量正相关(r=0.579,P=0.012:r=0.496,P=0.036)。病毒载量＜104拷贝/ml组HIV感染者NK细胞分泌IL-10水平与HIV病毒载量无相关性。　　 CD4＜350个/ul且病毒载量≥104拷贝/mlHIV感染者:NK细胞分泌IL-10水平与CD4+T细胞数最显著负相关(r=-0.867,P=0.001),与HIV病毒载量呈正相关趋势(r=0.588,P=0.074):在CD56dimNK细胞发现相似结果:分泌IL-10水平与CD4+T细胞数最负相关(r=-0.661,P=0.038),与HIV病毒载量正相关(r=0.697,P=0.025);CD56brightNK细胞分泌IL-10水平与CD4+T细胞数量呈负相关趋势(r=-0.491,P=0.150),与HIV病毒载量呈正相关趋势(r=0.552,P=0.098),但无统计学意义。　　 二、IL-12与IL-15体外刺激HIV感染者NK细胞及各亚群分泌IL-10、TGF-β特点　　 1、IL-12与IL-15体外刺激HIV感染者NK细胞分泌IL-10、TGF-β情况　　 采用10ng/ml重组IL-12与50ng/ml重组IL-15体外刺激,应用多色流式细胞仪胞内细胞因子染色(ICS)方法检测NK细胞分泌IL-10和TGF-β水平。结果显示:结果显示:重组IL-12与IL-15体外刺激后,HIV感染者NK细胞分泌IL-10水平高于NC组(P=0.014),分泌TGF-β水平有高于NC组趋势(P=0.059),但无统计学差异。　　 根据CD4高低分组,CD4＜350个/ul组HIV感染者NK细胞分泌IL-10水平高于NC组(P=0.017),分泌TGF-β水平有高于NC组趋势,但无统计学差异。CD4≥350个/ul组NK细胞分泌IL-10水平有高于NC组趋势,但无统计学差异,分泌TGF-β水平高于NC组(P=0.029)。　　 根据病毒载量高低分组,病毒载量≥104拷贝/ml组NK细胞分泌IL-10水平高于NC组(P=0.014),分泌TGF-β水平有高于NC组趋势,但无统计学差异。病毒载量＜104拷贝/ml组NK细胞分泌IL-10水平有高于NC组趋势,但无统计学差异,分泌TGF-β水平高于NC组(P=0.016)。　　 CD4＜350个/ul且病毒载量≥104拷贝/mlHIV感染者NK细胞分泌IL-10水平高于NC组(P=0.018),分泌TGF-β水平有高于NC组趋势,但无统计学差异。　　 2、IL-12与IL-15体外刺激HIV感染者NK细胞及各亚群分泌IL-10、TGF-β水平与CD4+T细胞计数及HIV病毒载量的相关性　　 rIL-12/rIL-15体外刺激后,HIV感染者NK细胞分泌IL-10、TGF-β水平与CD4+T细胞数量、HIV病毒载量无显著相关性,无统计学意义。但CD56brightNK细胞分泌IL-10水平与HIV病毒载量正相关(r=0.449,P=0.014),CD56dimNK细胞分泌IL-10水平与HIV病毒载量无相关性(r=0.221,P=0.412)。　　 CD4＜350个/ul且病毒载量≥104拷贝/mlHIV感染者:NK细胞分泌IL-10水平与CD4+T细胞数量负相关(r=-0.673,P=0.033),与HIV病毒载量呈正相关相关趋势(r=0.552,P=0.098);在CD56dimNK细胞、CD56brightNK细胞发现相似结果:分泌IL-10水平与HIV病毒载量呈正相关趋势,但无统计学意义(r=0.588,P=0.074;r=0.564,P=0.090)。　　 三、IL-10、TGF-β对NK细胞分泌IFN-γ、CD107a功能影响　　 采用重组IL-10与TGF-β体外与NK细胞共培养,观察其对NK细胞分泌IFN-γ、CD107a水平的影响。结果发现:rIL-10在24h时明显抑制NK细胞分泌IFN-γ,抑制率达82%;NK细胞分泌CD107a水平在48h时明显被rIL-10抑制,抑制率达34%。rTGF-β在24h时明显抑制NK细胞分泌IFN-γ,抑制率达100%NK细胞分泌CD107a水平在24h时亦明显被rTGF-β抑制,抑制率达57%。　　 结论：　　 1、HIV感染者NK细胞分泌IL-10水平较正常对照增高,分泌TGF-β水平有增高趋势。提示HIV感染导致NK细胞分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-β水平增多。　　 2、CD4＜350个/ul且病毒载量≥104拷贝/mlHIV感染者CD56dimNK细胞分泌IL-10水平与CD4+T细胞数量负相关,与HIV病毒载量正相关。提示HIV感染者NK细胞分泌的IL-10水平与HIV疾病进展相关。　　 3、IL-10、TGF-β抑制NK细胞IFN-γ和CD107a的分泌,提示IL-10、TGF-β抑制NK细胞的细胞毒性功能。