论文部分内容阅读
研究背景:过高的发病率是高脂血症受到全球社会广泛关注的主要原因之一,而且越来越多的疾病(诸如糖尿病、心脑疾病、骨质疏松症等等)都已被证明与高脂血症存在密切关系。在前期实验中,我们观察到高脂血症组大鼠较正常组大鼠种植体周围骨质疏松,骨结合率较低,成骨细胞减少,破骨细胞增多等现象。高脂血症的高发病率和其对骨代谢的不良影响,已成为影响种植修复的潜在危险因素,因此研究高脂血症对种植体骨整合的影响有重要的现实意义。卷曲受体蛋白9(frizzled-9,FZD9)是Wnt通路上细胞膜FZD受体家族中的一员,对于骨代谢有重要意义。而microRNA(miRNA)能与靶基因的mRNA相互作用从而直接降解靶mRNA或抑制靶基因的翻译。因此本实验旨在寻找出在高脂环境下,miRNA通过作用于FZD9从而来影响骨代谢的具体机制。实验目的:(1)观察高脂环境下大鼠骨髓机制干细胞(BMSCs)成骨分化过程中Runx2、ALP、FZD9、miR-125a-5p、miR-125b-5p 的表达变化(2)过表达/抑制表达miR-125a-5p、miR-125b-5p后,观察BMSCs成骨分化过程中FZD9表达量的变化。(3)通过生物信息学软件预测miR-125a-5p、miR-125b-5p和FZD9的靶结合区域,并使用双荧光素酶报告基因系统对其进行验证。实验方法:(1)从大鼠股骨出获取元代BMSCs,并用流式实验检测细胞干性。培养到第三代时,将细胞随机分为实验组(高脂组)、对照组(正常组),分别用高脂成骨诱导液和普通成骨诱导液进行成骨诱导。诱导3、5、7、10、14天,利用RT-PCR检测成骨基因Runx2、ALP,Wnt信号通路中FZD9,以及可能调控FZD9表达的miR-125a-5p、miR-125b-5p的mRNA表达。成骨诱导28天,对细胞进行茜素红染色和油红0染色,观察两组细胞成骨分化情况。(2)通过转染 miR-125a-5p、miR-125b-5p mimic/inhibitor 来实现对miR-125a-5p、miR-125b-5p的抑制表达,48h后利用RT-PCR检测转染效率,并检测转染后FZD9的mRNA的表达变化,使用Western blot检测BMSCs中FZD9蛋白的表达变化。(3)利用生物信息学软件预测miR-125a-5p、miR-125b-5p与FZD9的靶结合区域,并通过预测结果构建野生型(WT)和突变型(Mut)的荧光素酶报告基因载体,使用双荧素酶报告基因系统对预测的靶结合区域进行验证。实验结果:(1)高脂环境下,BMSCs向成骨细胞分化受到抑制,形成矿化结节数量较少,形成脂滴数量较多。高脂环境下,BMSCs向成骨细胞分化过程中成骨相关因子Runx2及ALP表达减少,从分子层面上说明高脂环境抑制BMSCs成骨分化。高脂环境下,BMSCs向成骨细胞分化过程中FZD9表达量减少、miR-125a-5p 和 miR-125b-5p 表达量升高,提示 FZD9、miR-125a-5p和miR-125b-5p表达量会受到高脂环境的影响。(2)通过 RT-PCR 和 Western blot 实验得出,miR-125a-5p,miR-125b-5p mimics转染细胞后,FZD9 表达下调明显;miR-125a-5p,miR-125b-5p inhibitor 转染细胞后,FZD9表达上升。说明miR-125a-5p,miR-125b-5p的表达与FZD9的表达呈负相关。(3)通过双荧光素酶检测荧光活性结果综合分析,证实miR-125a-5p,miR-125b-5p通过与FZD9 3’UTR的靶位点相结合,从转录后翻译水平直接抑制了 FZD9的表达,从而抑制BMSCs向成骨细胞的转化。