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目的:通过对人骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)的分离、纯化和鉴定,以及诱导BMSCs体外成骨分化,过表达hsa-miR-223-3p,探讨hsa-miR-223-3p对BMSCs成骨分化细胞的调控作用。方法:抽取新鲜人骨髓10 mL,通过肝素(2500 U/mL,0.5 mL)抗凝后注入预置有Percoll密度梯度离心液的试管内,通过Percoll密度梯度离心法来分离纯化单个核细胞。利用10%FBS DMEM完全培养基培养人骨髓间充质干细胞。结合免疫细胞化学检测鉴定贴壁的人骨髓间充质干细胞上相关表面抗原标志物的表达。使用含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的成骨诱导液诱导人BMSCs向成骨细胞分化。分别于细胞诱导培养的第7天、14天、21天,进行培养液ALP水平的检测以及细胞茜素红染色。在诱导成功的成骨细胞中,过表达hsa-miR-223-3p,通过实时荧光定量PCR方法检测Wnt信号通路标志物Wnt5a及其下游信号分子OPG、RUNX2的mRNA水平的变化。在蛋白水平上,通过Western blot方法检测Wnt5a、OPG和RUNX2表达的变化。通过生物信息学软件发现Wnt5a上有hsa-miR-223-3p的结合位点,构建pmirGLO/Wnt5a-3’UTR和pmirGLO/Wnt5a-3’UTR mut质粒,分别与hsa-miR-223-3p mimcs/NC共转染至293T细胞。通过双荧光素酶报告基因实验验证hsa-miR-223-3p与Wnt5a的靶定关系。结果:1.通过Percoll密度梯度离心法分离培养的细胞呈扁平的纺锤形,与成纤维细胞类似;细胞核相对较大,核仁一个或为多个,胞浆丰富。免疫细胞化学检测检测结果显示:CD 34、CD 45呈阴性表达,排除造血组织来源细胞,CD 44呈阳性表达,提示所培养的细胞为人骨髓间充质干细胞,保证了研究对象的准确性。2.随着成骨诱导时间的延长,检测到培养液中ALP的水平逐渐增加,茜素红细胞染色见暗红色或红褐色钙盐结节沉积逐渐增加。说明在体外可以成功诱导BMSCs的成骨分化。3.在BMSCs经体外诱导的成骨细胞中,过表达hsa-miR-223-3p,Wnt5a、OPG、RUNX2的mRNA水平和蛋白水平都是降低的(P<0.05)。4.hsa-miR-223-3p可直接靶定Wnt5a的3’UTR区,降低Wnt5a的荧光素酶的活性。当突变掉hsa-miR-223-3p与Wnt5a结合的种子序列后,这种靶定作用消失。当封闭hsa-miR-223-3p后,野生型Wnt5a的荧光素酶的活性增加,而突变型Wnt5a的荧光素酶的活性不变。结论:通过Percoll密度梯度离心法分离培养的细胞具有人骨髓间充质干细胞的各种特性。在BMSCs成骨细胞分化细胞中,过表达hsa-miR-223-3p可以影响Wnt信号通路标志物Wnt5a及其下游信号分子OPG、RUNX2的表达。hsa-miR-223-3p可直接与Wnt5a结合,Wnt5a作为hsa-miR-223-3p的下游靶基因,受其负向调控。