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目的四嗪二甲酰胺(ZGDH-1)是根据药物构效学设计并合成的新四嗪类化合物,本文选用粒系Kasumi-1白血病细胞为靶细胞,采用现代科学方法,观察ZGDH-1抑制白血病细胞增殖、诱导凋亡及阻滞白血病细胞于G2/M期的效应,并探讨其相关作用机制,为日后将该药物与多种中药材联合用药治疗白血病奠定理论基础。方法①Kasumi-1细胞经不同浓度0、50、100、200、500、1000μg/L的ZGDH-1分别孵育24、48和72h后,采用细胞记数和MTT实验观察ZGDH-1抑制细胞增殖情况。②瑞氏染色和Hoechst33258荧光染色观察ZGDH-1作用后细胞形态学变化和凋亡小体的形成;流式细胞术检测Annexin V阳性的早期凋亡细胞和DNA亚二倍体;Western免疫印迹法检测细胞内半胱氨酸天冬氨酸酶Caspase-3蛋白的活性等。③Western免疫印迹法分析药物孵育后细胞内IκB和Nf-1κB蛋白表达的变化。④实时定量PCR和Western免疫印迹法分析药物作用后Kasumi-1细胞内融合基因AML1-ET0及其蛋白表达的变化。⑤流式细胞术和Western免疫印迹法分析ZGDH-1诱导白血病细胞凋亡线粒体通路相关调控分子Bc1-2、Bax和Bad蛋白的表达,以及线粒体膜蛋白、膜电位变化和细胞内氧自由基的堆积情况。⑥流式细胞术分析ZGDH-1对Kasumi-1细胞周期的影响;Western免疫印迹法分析G2/M期多种周期相关蛋白及激酶表达的变化,同时,加入CHK1蛋白激酶抑制剂CHIR-124后,检测细胞周期及相关蛋白表达水平的改变。结果①ZGDH-1能够显著地抑制Kasumi-1细胞增殖,呈剂量和时间的依赖性。②瑞氏染色和Hoechst33258荧光染色后,细胞内均出现了凋亡小体;经ZGDH-1处理后Annexin V阳性细胞率为25.8%,明显高于对照组的11.3%(P<0.05);流式细胞术检测出凋亡相关的DNA亚二倍体;100μg/LZGDH-1作用48h后,能明显激活Caspase-3,其作用底物PARP产生了明显的剪切片段。③ZGDII-1能够诱导白血病细胞IκB转录调控蛋白的表达,同时,抑制Nf-κB转录调控蛋白的表达。④ZGDH-1能够在蛋白水平降解Kasumi-1细胞特征性的白血病融合基因AML1-ET0。⑤ZGDH-1作用后Bc1-2蛋白的水平无明显改变,而Bad和Bax蛋白的表达水平明显增高;ZGDH-1亦能诱导细胞内氧自由基的堆积,引起细胞膜通透性和膜电位的改变。⑥当ZGDH-1浓度达到200μg/L时,开始阻滞白血病细胞周期于G2/M期,当浓度高达500μg/L时,大部分细胞停留于G2/M期。同时,ZGDH-1能够下调细胞周期蛋白cyclinB1和蛋白激酶cdc2、cdc25c的表达水平,上调CHK1、P53和P27蛋白的表达,并改变这些蛋白的磷酸化状况。结论ZGDH-1在体外能够显著地抑制白血病细胞Kasumi-1增殖,通过上调I k B的表达而解除了 NFk B的保护机制,并降解白血病特异性AML1-ET0融合蛋白而发挥其抗白血病的效应。ZGDH-1通过线粒体途径诱导Kasumi-1细胞凋亡,诱导细胞内氧自由基的堆积,对促进细胞凋亡发挥了一定的作用。ZGDH-1能够阻滞白血病细胞进入有丝分裂期,其作用机制可能通过下调细胞周期蛋白cyclinB1和蛋白激酶cdc2、cdc25c的表达;上调CHK1,使cdc25c过度磷酸化;上调P53和P27蛋白的表达,抑制cdc2与cyclinB1的结合,从而阻滞白血病细胞于G2/M期。ZGDH-1可显著引起的对急性粒细胞性白血病的致病性AML-ETO融合蛋白的降解破坏,因此具有“去邪”的作用;促进细胞周期的蛋白明显得到压制,而抑制细胞周期的蛋白显著增多,从而恢复正邪对比和阴阳平衡。