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职业性三氯乙烯(trichloroethylene, TCE)接触引起的药疹样皮炎已成为严重危害接触工人健康的职业卫生问题。目前,根据其临床症状和流行病学研究普遍认为其发病机制可能是以细胞免疫为主的Ⅳ型超敏反应。但是,由于超敏反应发生机制的复杂性,TCE药疹样皮炎的具体发病机制尚未完全阐明。同时缺乏适当的的动物模型已经严重限制了其发病机制的研究。细胞因子在超敏反应的诱导、T细胞增殖分化以及效应阶段均发挥着重要作用,关于细胞因子的研究已经广泛应用于药物诱发的超敏反应,并将细胞因子的表达水平作为疾病发生严重程度及疾病病程进展的效应标志物。因此,本研究首先从细胞因子的角度探讨了TCE本身及其体内代谢产物在TCE药疹样皮炎发病过程中的作用；根据课题组前期人群病例-对照研究中发现的HLA-B*1301这一易感基因,进一步利用转基因技术构建相应的基因导入小鼠并尝试建立TCE药疹样皮炎的疾病动物模型,以细胞因子表达变化、T细胞活化、增殖及皮肤、肝脏组织病理变化等指标作为疾病模型构建成功的标志并探讨HLA-B*1301基因在发病过程中的功能,以期为研究TCE药疹样皮炎发病机制提供线索。1.三氯乙烯诱导细胞因子表达变化及其调控机制结合人群和体外细胞研究,利用液态悬浮芯片和ELISA的方法分别检测了IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α在人群外周血血清和HaCaT细胞培养上清的表达水平；免疫印迹法检测NF-κB信号通路中p65和IκBα在细胞总蛋白中的表达及其磷酸化水平以及p65细胞核内转移的蛋白量；ELISA检测细胞核内p65与DNA的结合活力；利用NF-κB通路的化学抑制剂Bay11-7082证明NF-κB信号通路与细胞因子表达之间的关联。结果显示：1)比较TCE药疹样皮炎病人、TCE暴露工人和TCE非暴露工人外周血血清中前炎性因子的表达水平,发现病例组血清中IL-1β(p=0.033, p=0.015)、IL-6(p<0.001).IL-8(p<0.001,p=0.002)和]NF-α(p=0.009,p=0.005)的水平显著高于其它两组,而在TCE暴露组和非暴露组间无显著性差异。相关性分析发现这四种细胞因子表达水平间存在正相关,未发现其与疾病的发病时间之间有相关性。2)以HaCaT细胞为模型,用TCE主要的体内代谢产物TCOH和TCA处理细胞后,发现TCOH够以剂量-效应的方式增加HaCaT细胞IL-1a和IL-6的表达水平以及以剂量、时间-效应的方式激活NF-κB信号通路,未发现TCA有类似作用。以Bay11-7082抑制NF-κB通路后,IL-6的表达被抑制而IL-1α表达未受影响。2.人类HLA-B*1301/p2M双转基因小鼠的构建及TCE药疹样皮炎转基因小鼠模型的探讨分别将人HLA-B*1301基因和β2M基因cDNA克隆至pUbC真核表达载体,成功构建pUbC-B&1301和pUbC-β2M重组质粒。采用显微注射的方式将线性化的重组质粒导入C57BL/6小鼠受精卵中,并随机整合到小鼠基因组中。对出生后的小鼠进行PCR鉴定,选择携带目的基因的小鼠进行繁育F1、F2代并筛选出携带目的基因的子代小鼠进行mRNA表达的鉴定,筛选出了mRNA高表达并稳定遗传的首建鼠各三个品系进行繁育,扩大种群数量。进一步取首建鼠进行两两杂交,采用流式检测的方法,筛选出HLA-B*1301蛋白高表达的HLA-B*1301/β2M双基因小鼠并进行批量繁殖。以野生C57BL/6小鼠和HLA-B*1301/β2M双转基因C57BL/6小鼠为模型鼠,应用腹腔注射联合皮肤涂抹的体内染毒方式,比较两种小鼠在染毒1周和2周后的免疫学效应的变化,所选效应指标包括：细胞因子表达、T细胞增殖、体内外T细胞活化和皮肤、肝脏组织病理。结果显示：1)小鼠连续体内染毒1周后,分离外周血血清并检测IFN-γ、IL-4、IL-6、TNF和IL-1p的表达水平,无论野生小鼠还是转基因小鼠,染毒组血清IL-6水平均高于未染毒组,差异具有统计学意义(p<0.05),而血清IFN-γ、IL-4、TNF和IL-1p水平在两组之间均未见显著性差异。小鼠连续体内染毒2周后,野生小鼠染毒组与未染毒组相比较,血清IL-6水平仍高于未染毒组,差异具有统计学意义(p<0.05),而转基因小鼠染毒组血清IL-6水平降低,与未染毒组比较差异无统计学意义。未发现血清IFN-γ、IL-4、TNF和IL-1p水平在两组之间的差异具有统计学意义。2)小鼠连续体内染毒1周后,分离脾细胞体外培养并分别以O.1mMTCE、0.2mMTCOH,5μg/ml ConA处理48小时后,以CCK-8法检测T细胞增殖,结果发现：野生鼠脾细胞体外ConA处理后T细胞明显增殖,但染毒组和对照组小鼠T细胞增殖水平差异无统计学意义。而双转基因小鼠脾细胞体外ConA处理后T细胞增殖水平在染毒组和对照组小鼠间存在差异,差异具有统计学意义(p<0.05)。同时还发现双转基因小鼠脾细胞体外TCOH处理后T细胞增殖水平也显著增加(p<0.05)。以EdU掺入法来检测T细胞增殖,不论野生鼠还是双转基因鼠,脾细胞体外ConA刺激后T细胞增殖量在染毒组和非染毒组小鼠间均存在差异,差异具有统计学意义(p<0.05)。未发现双转基因小鼠脾细胞体外TCOH处理后T细胞增殖量在染毒组和对照组小鼠间存在差异。小鼠连续体内染毒2周后,以CCK-8法检测T细胞增殖,无论是野生鼠还是双转基因鼠,脾细胞体外ConA处理后T细胞增殖在染毒组和对照组小鼠间均无显著性差异。EdU掺入法检测发现染毒组小鼠脾细胞体外ConA处理后T细胞增殖量均比对照组小鼠下降,但差异无统计学意义。3)比较两种小鼠在体内连续染毒1周后的淋巴结细胞与脾细胞的活化程度,结果表明：无论是野生鼠还是双转基因鼠,染毒组小鼠体内CD3+、CD3+CD4+、 CD3+CD8+、CD3+CD25+及CD3+CD69+细胞比例与对照组比较均无显著性差异。体内连续染毒2周后分离小鼠脾细胞和淋巴结细胞体外培养并分别以0.1mMTCE、0.2mMTCOH,5μg/ml ConA处理48小时后,流式细胞仪检测T细胞活化,发现野生小鼠染毒组淋巴结CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞比例与对照组比较均降低,其中ConA处理后淋巴结CD3+细胞的下降具有统计学意义(p<0.05)；双转基因小鼠染毒组淋巴结CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞比例均比对照组显著下降(p<0.01),并且ConA处理后染毒组淋巴结CD3+CD25+及CD3+CD69+细胞比对照组也显著下降(p<0.05)。未发现两种小鼠脾细胞体外活化程度有显著性差异。4)肝脏和背部皮肤组织HE染色结果表明：体内连续染毒2周后,野生小鼠染毒组4只小鼠中有1只背部皮肤组织出现较明显炎细胞浸润,染毒组肝脏组织及对照组皮肤、肝脏组织均无病理变化。转基因小鼠染毒组4只小鼠中有1只背部皮肤组织出现较严重炎细胞浸润同时伴有肝细胞水肿等病理变化,对照组皮肤及肝脏组织均无病理变化。综上所述,1)本研究结果提示TCOH主要通过激活HaCaT细胞NF+κB通路来增加IL-6的表达水平,并且TCOH在TCE药疹样皮炎发病中发挥着主要作用。IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α四种细胞因子可能参与了TCE药疹样皮炎的发病过程,其表达水平可以作为TCE药疹样皮炎动物模型构建成功的效应标志之。2)通过比较野生小鼠和双转基因小鼠在体内TCE染毒后各效应指标的变化,发现与对照组小鼠比较,TCE增强了小鼠机体的免疫功能；与野生小鼠比较,HLA-B*1301/β2M双转基因小鼠对TCE的免疫毒性作用更敏感；两种小鼠在体内连续TCE染毒后,机体免疫功能均呈现先增强后抑制的现象。虽然本次研究尚未建立起理想的TCE药疹样皮炎动物模型,但是本研究结果为今后的进一步完善和改进提供了重要基础,为疾病动物模型的成功建立提供了科学依据。