热应激（Heat Stress,HS）是指环境温度高于正常体温后所引起的畜禽生物体内的特异性应答反应。HS引起的哺乳动物生精障碍,不仅影响了其繁殖性能,降低了动物福利,增加了养殖业的经济成本,也是雄性不育的重要原因。睾丸支持细胞（Sertoli Cells,SCs）对精子发生至关重要,其通过为发育中的生精细胞提供结构支撑和营养支持,促进血睾屏障（Blood-Testis Barrier,BTB）的形成及生精细胞的分化和增殖,为精子生成“保驾护航”。因此SCs的数量不仅决定了生殖细胞的发育能力,也影响了雄性成年期最终的睾丸大小。以往的研究表明HS通过上调miRNAs表达导致SCs乳酸生成增加,并通过诱导氧化应激造成SCs自噬和凋亡,HS是否对睾丸内SCs中其他代谢物（如脂肪酸）产生影响?其潜在的机制是否与miRNA所介导的氧化应激有关?这一反应所诱导的细胞形态变化是什么?目前尚不清楚。本研究分别采用离体（一月龄左右的仔猪睾丸SCs）和在体（6周龄左右小鼠）模型,应用代谢组学、转录组学、生物信息学以及分子生物学等研究手段和方法,揭示HS对SCs代谢及功能的影响。离体试验旨在探究HS对SCs脂质代谢和细胞自噬的影响及内在机制,在体试验旨在验证离体试验的作用机制,并确定是否影响生精功能?本文所得研究结果如下:1.支持细胞离体热应激模型的建立及差异代谢物的筛选本节旨在挖掘SCs中响应HS胁迫的差异代谢物。首先摸索离体的HS条件,检测了不同时间和不同温度处理条件下SCs的状态。结果显示,与正常培养（32°C,30 min）的细胞相比,细胞活力随温度增加先增后减,34°C和36°C,30 min处理的细胞增殖活性显著上升（P<0.01）,但在38°C～44°C条件下,细胞活力逐渐降低（P<0.05）。将SCs培养于44°C条件下,给予5 min间隔的处理,细胞活性先呈短暂性的增加,随后逐渐降低,细胞毒性呈阶梯式增加。在44°C,30 min时细胞活性最低,毒性最大（P<0.05）,但HS处理撤除后能逐渐恢复细胞活性。44°C处理30 min,细胞早期凋亡率较对照组升高2倍（P<0.05）,但其晚期凋亡率和对照组无明显差别（P>0.05）。透射电镜分析显示HS组中出现了自噬囊泡,且线粒体数量减少,线粒体嵴形态模糊甚至萎缩。以上结果表明:44°C,30 min处理诱导了细胞自噬和凋亡。利用液相质谱色谱代谢组检测发现,正离子模式下鉴定出9352个代谢物,其中上调199个,下调184个;在负离子模式下鉴定出7304个代谢物,其中117个上调,143个下调。经数据剔除及归一化处理后,得到分子特征（均为正、负离子模式）的20种差异代谢物。它们参与了碳水化合物、氨基酸、脂质、抑菌抗氧化、激素代谢的过程。HS影响的SCs能量产生相关的代谢物中,以糖类为主的半乳糖的变化最为明显（FC=7.62,P<0.01）,其次是甘油(（FC=4.88,P<0.01）。脂肪酸类代谢物以花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）上调最为显著（FC=2.34,P<0.01）,且其上下游衍生物亚油酸,前列腺素,白三烯均有明显差异（P<0.01）。这表明,以AA为中心的脂肪酸类代谢可能在HS诱导的SCs功能调节中起重要作用。2.热应激通过花生四烯酸诱导支持细胞自噬产生的作用机制AA及其主要代谢产物在细胞增殖与分化、信号激活与炎症、营养供应与能量代谢等病理生理过程中发挥了重要作用。本节旨在揭示HS通过诱导AA生成,参与SCs自噬反应的潜在机制。结果显示:花生四烯酸组（AAT）和HS组导致细胞活力均降低（P<0.05）,细胞轮廓模糊,出现萎缩,核质分布均匀度降低,紧密连接蛋白Claudin 5和Claudin 11的表达降低,细胞膜的完整性下降（P<0.05）。此外,AAT和HS组促进了细胞内的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的生成（P<0.05）,表明这两个处理均诱导了氧化应激。过度的氧化应激导致自由基增加,ROS积聚增多,抑制了线粒体D-loop环的复制（P<0.01）,激活了呼吸链蛋白ComplexⅠ、Ⅱ和ν的表达（P<0.05）,产生了电子漏现象,并促进了乳酸生成（P<0.05）。受损的线粒体导致了Ca2+外泄,并流入内质网,造成内质网离子负载,随后激活了内质网应激蛋白IRE1的磷酸化活性和磷酸化JNK蛋白的表达（P<0.05）,引起了内质网应激。此外,过度的氧化应激造成了线粒体和内质网结构损伤,进而诱导了细胞自噬蛋白LC3I向LC3II转化（P<0.05）,促进了溶酶体蛋白LAMP2的表达（P<0.05）,增强了溶酶体活性,诱导了自噬囊泡及自噬溶酶体形成。分别添加抗氧化剂NAC,内质网应激抑制剂4-PBA和自噬抑制剂Bafilomycin A1和花生四烯酸抑制剂Diethylcarbamazine citrate处理细胞,发现它们可缓解HS通过AA诱导的氧化应激及线粒体和内质网损伤,并降低ROS、MDA和Ca2+的产生（P<0.05）,减轻细胞自噬行为（P<0.05）。以上结果说明HS下的SCs通过增强AA代谢,诱导氧化应激,造成细胞器损伤,激活胞内自噬。3.热应激通过miR-145-5p诱导花生四烯酸生成介导支持细胞自噬的产生miRNA在细胞生长和脂质代谢中发挥调控作用。本节旨在探究靶向AA生成的上游靶m RNA及miRNA,揭示它们通过诱导AA生成介导SCs自噬的潜在机制。首先利用全转录组测序和生物信息学分析相结合的方法挖掘潜在的miRNA及m RNA。结果显示:在三个生物学重复中共筛选到了804个差异变化的miRNA,经过KEGG通路富集分析发现这些miRNA富集在1)脂肪酸延长或分解通路（P<0.05）,2)磷脂酰肌醇信号通路（P<0.05）,3)细胞色素P450代谢通路（P<0.05）。GO功能分析显示他们参与调控了:1)RNA、DNA、蛋白质的转录翻译过程（P<0.05）,2)线粒体、内质网,高尔基体功能（P<0.05）,3)细胞骨架结构和膜完整性功能（P<0.05）,这些结果提示这些miRNA可能参与了细胞内的脂质代谢,并影响细胞膜或细胞器损伤的过程。利用生物信息学分析及基因克隆方法和双荧光素酶报告基因系统,验证miR-145-5p和PLA2G4A（PLA2G4A可诱导AA的生成）的靶向关系。结果显示:miR-145-5p mimics和psi-CHECK2-WT-PLA2G4A-3’UTR共转染组显著降低了工具细胞（HEK293T细胞）的荧光活性（P<0.05）,而miR-145-5p inhibitor和psi-CHECK2-WT-PLA2G4A-3’UTR则会提高该细胞的荧光活性（P<0.05）。突变型psi-CHECK2-MUT-PLA2G4A-3’UTR和mimic/inhibitor共转染组对细胞的荧光活性没有影响。Western Blot检测发现,HS诱导miR-145-5p表达下调（P<0.05）,PLA2G4A表达上调（P<0.05）,它们在HS下的表达变化呈负相关。此外,在转染了mimic或inhibitor后,PLA2G4A的表达显著被抑制或激活。这些结果提示miR-145-5p是PLA2G4A的直接靶miRNA,HS通过miR-145-5p靶向PLA2G4A影响了AA生成。利用mimic或inhibitor过表达或敲低miR-145-5p,用siRNA敲低PLA2G4A,研究了它们对SCs功能的影响。结果显示,mimic和siRNA降低线粒体呼吸链的复合物ComplexⅠ、Ⅱ与ν的表达（P<0.05）,降低了ROS和MDA的水平（P<0.05）,缓解了氧化应激,降低了自噬相关蛋白LC3的表达（P<0.05）,同时增加了P62的表达（P<0.05）,阻碍了自噬囊泡和溶酶体的形成。以上结果说明HS通过增加miR-145-5p表达,降低AA生成,抑制SCs发生自噬,反之亦然。4.热应激诱导的支持细胞中花生四烯酸代谢对雄性生精能力的影响为研究AA诱导的SCs自身自噬是否影响生精过程。本节中,将6周龄左右雄性小鼠连续3天暴露于温度40°C,相对湿度60.00%±2.31的智能孵化室里或给予小鼠腹腔注射100μm AAT、AAY、AAT+NAC连续7～10天,检测了它们对睾丸形态及雄性繁育能力的影响。形态学结果显示,AAT和HS组睾丸组织形态充盈,有部分充血。AAT组中睾丸重/体重比均高于其他各组（P<0.05）。对生精上皮HE染色后发现AAT和HS组小鼠睾丸生精上皮出现严重萎缩,部分生精小管的内腔面积增大,整个生精小管的细胞极性消失,基膜不完整,各级生精细胞呈不同程度脱落,层数减少。利用免疫组织化学（IHC）的检测睾丸组织生精上皮中SCs标记蛋白GATA-4的表达情况。结果显示,AAT和HS处理后,蛋白的表达散乱的分布在整个生精小管内,且有向中间管腔部位偏移的趋势,表明SCs数量减少。但通过加入AAY或NAC干预后,细胞形态和GATA-4蛋白分布得到了明显改善。此外,AAT和HS组诱导了雄鼠MDA浓度的升高（P<0.05）和总抗氧化能力（Total oxidation resistance,T-AOC）含量的降低（P<0.01）,使睾丸组织中ROS荧光活性的增强,并促进了线粒体呼吸链复合物中Complex I,П,ν蛋白的表达（P<0.05）。激光共聚焦结果显示,在AAT和HS组中,中央细胞自噬水平强于曲细精管内部,而这两处的自噬水平又比基底层强,生精上皮中部荧光由清晰的点状分布转变为弥漫性分布,提示SCs和生精细胞均发生了自噬,且自噬程度较高。另一方面,Western Blot结果显示,AAT和HS组中均存在LC3-I向LC3-II的转化和P62的降解（P<0.05）,但随着NAC和AAY的添加,自噬水平先增加后逐渐回落,促进了组织的修复过程。精子活力检测发现,AAT和HS组的附睾中虽然存有大量的精子,精子却着色深,异常精子居多,只有少许圆形的细胞碎片残留,提示AA造成了雄性精子损伤。繁殖能力检测显示,与AAT组雄鼠交配后雌鼠无法获得生育能力,妊娠失败,与HS组交配的母鼠受孕时间延长且产仔数低,子代初生重低（P<0.05）,这些结果提示HS诱导的AA生成造成了雄性繁殖能力下降。综上所述,HS通过降低miR-145-5p表达,增强了PLA2G4A的表达,提高了SCs中游离脂肪酸AA的水平,导致脂质过氧化物类ROS增多,激活了氧化应激,进而损伤了SCs线粒体,引起了内质网应激,诱导了细胞自噬,阻碍了精子的生成。抑制AA生成或添加抗氧化剂NAC后可逆转HS诱导的雄性生精能力下降。本研究揭示了HS引起的雄性生殖能力下降的分子病因,也为筛选提高公猪耐热性的小分子代谢物提供了参考。