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肥胖症作为一种营养代谢性疾病,是心脑血管疾病、糖尿病、高血压、高脂血症以及癌症等多种疾病的高危因素,现已成为全球性的健康问题。多年来研究发现肥胖的发生与下丘脑对摄食的神经内分泌调控密切相关,由下丘脑分泌的促食肽黑色素浓集激素（MCH）及其受体（MCHR1和MCHR2）的发现为肥胖发生机制及防治的研究提供了新的靶点。通过构建转基因和基因敲除动物模型已对MCH及MCHR1与肥胖及能量代谢的关系进行了深入细致的研究,但有关MCHR2的功能及其与肥胖的关系至今仍不清楚。因此,本课题一方面构建了靶向人MCHR2基因的siRNA重组腺病毒载体,以便从动物水平研究MCHR2的功能;另一方面构建了两个稳定表达MCHR2基因的细胞株:SH-SY5Y-MCHR2及SHG-44-MCHR2,并利用这两个细胞株进行MCHR2功能的蛋白质组学研究,从细胞蛋白整体水平探讨MCHR2功能及作用机制。研究内容包括以下三个部分:1.人MCHR2基因siRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定。方法:人工合成靶向MCHR2的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体p SES-HUS上得到p SES-HUS-MCHR2siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MCHR2siRNA,在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染稳定转染MCHR2的CHO细胞株CHO-MCHR2,RT-PCR及Western Blot检测腺病毒对细胞MCHR2表达的影响。结果:pSES-HUS-MCHR2siRNA经Kpn I、EcoR V双酶切后只有8500bp左右的条带,同时测序结果正确,证明构建成功。重组腺病毒质粒经Pac I酶切后可见一条4.5kb和一条约30kb的条带,表明同源重组成功。线性化同源重组的腺病毒,转染293细胞,于荧光显微镜下可见红色荧光表达。Adeasy-MCHR2siRNA（50pfu/cell）处理CHO-MCHR2细胞48h后,RT-PCR及Western Blot检测到MCHR2在转录与蛋白水平的表达都明显降低（相比Adeasy-SES-HUS对照组）。结论:成功构建MCHR2siRNA重组腺病毒载体,Adeasy-MCHR2siRNA腺病毒能有效地抑制CHO-MCHR2细胞中MCHR2表达,能够用于动物水平研究MCHR2功能。2.稳定表达人MCHR2基因的SHG-44-MCHR2及SH-SY5Y-MCHR2细胞株的建立与鉴定。方法:①PCR法从人胎脑cDNA文库扩增MCHR2全长cDNA片段。用基因重组方法将其克隆到pcDNA3.1（+）,构建真核表达载体pcDNA3.1（+）MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SHG-44细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的SHG-44细胞系,命名为SHG-44-MCHR2,用RT-PCR、Westernblot及免疫荧光法检测MCHR2的表达,并检测细胞内Ca2+流动。②用基因重组方法将MCHR2全长cDNA克隆到质粒pEGFPN1,构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SH-SY5Y细胞,通过G418筛选,建立稳定表达MCHR2的SH-SY5Y-MCHR2细胞系命名为SH-SY5Y-MCHR2,采用RT-PCR、Western blot检测MCHR2的表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位。结果:①扩增出MCHR2全长cDNA;成功构建pcDNA3.1-MCHR2;RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测SHG-44-MCHR2到MCHR2的表达,并准确定位于细胞膜上。MCH作用于MCHR2后,可促使细胞内钙库释放Ca2+进而使胞内Ca2+浓度出现明显而短暂的升高,Ca2+振荡过程在MCH刺激后30～50s内完成。②成功构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2;RT-PCR、Western blot检测到SH-SY5Y-MCHR2细胞MCHR2的表达,激光共聚焦显微镜观察转染pEGFPN1-MCHR2的SH-SY5Y-MCHR2细胞融合蛋白定位于细胞膜,而转染空质粒pEGFPN1的SH-SY5Y细胞（命名为SH-SY5Y-mock）EGFP定位于全细胞。结论:成功建立了稳定表达MCHR2基因的SHG-44-MCHR2及SH-SY5Y-MCHR2细胞株,为后续关于MCHR2功能的体外蛋白质组学研究打下了基础。3.人MCHR2基因功能的蛋白质组学研究。方法:通过双向凝胶电泳分离MCH处理后的SHG-44-MCHR2细胞与其对照细胞SHG-44-mock、SH-SY5Y-MCHR2细胞与其对照细胞SH-SY5Y-mock细胞总蛋白,并对2-DE条件进行优化,最终选取了SH-SY5Y-MCHR2细胞与其对照细胞SH-SY5Y-mock细胞PH3-10NL胶条（上样量200μg）的电泳图进行PDQuest图像分析,MALDI-TOF质谱鉴定,Mascot软件查询SWISS-PORT蛋白质数据库;半定量RT-PCR检测INSIG2、ACOT8、IDH3A、PCK1、PFKFB4 mRNA水平变化,Western blot在蛋白质水平对IDH3A及PFKFB4进行验证。结果:MCH处理后的SH-SY5Y-MCHR2细胞与其对照细胞SH-SY5Y-mock细胞用PH3-10NL胶条（上样量200μg）获得分辨率高、重复性好的细胞双向电泳图谱,图像分析显示有43个蛋白斑点表达有差异,经MALDI-TOF检测,鉴定了34个可能蛋白,21个上调表达（IDH3A、PCK1、PFKFB4、ACSM5等）,13个下调表达（INSIG2、ACOT8、RAB2B等）。MCH处理后的SH-SY5Y-MCHR2细胞IDH3A、PCK1、PFKFB4 mRNA表达上调,而INSIG2、ACOT8mRNA表达下调。IDH3A、PFKFB4蛋白质在MCH处理的SH-SY5Y-MCHR2细胞中表达上调。结论:MCH处理后的SH-SY5Y-MCHR2细胞与其对照细胞SH-SY5Y-mock细胞有多种蛋白质差异表达,这些蛋白质参与细胞的脂代谢、糖代谢、能量代谢及细胞转运等多种信号通路,提示MCHR2可能通过这些蛋白质参与了能量平衡的调节,并可能与肥胖、糖尿病等疾病相关联。